一种以组氨酸激酶AgrC为靶点的药物筛选模型制造技术

本发明专利技术涉及一种以组氨酸激酶AgrC为靶点的药物筛选模型，属于生物医药领域。该模型包括如下步骤：(1)提取与纯化AgrC蛋白；(2)确定AgrC蛋白的浓度；(3)以DOPC、DPPA、CHOL为原料制备脂质体；(4)利用表面活性剂介导的方法将提取并纯化后的AgrC蛋白镶嵌到脂质体中形成蛋白脂质体；(5)构建以组氨酸激酶AgrC为靶点的药物筛选模型。本发明专利技术构建的药物筛选模型，适用于筛选对组氨酸激酶AgrC具有较强抑制效果的药物单体化合物，筛选出的化合物作用位点明确；采用此药物筛选模型对药物单体化合物的筛选具有高通量、特异性强、操作便捷等优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医药领域，具体的涉及一种以组氨酸激酶AgrC为靶点的药物筛选模型。
技术介绍
附属基因调节系统(accessorygeneregulator,agr)是葡萄球菌最重要的毒力因子调控系统，与多种毒力因子的产生和生物被膜的形成密切相关。agr系统由信号受体AgrC和反应调节子AgrA组成，属于典型的双组份信号转导系统(twocomponentsignaltransductionsystem,TCST)。组氨酸蛋白激酶AgrC作为TCST的信号受体,能被外界环境中的同源信号分子激活,发生自我转移磷酸化,磷酸化后的AgrC使AgrA磷酸化,活化后的AgrA可以与下游启动子RNAII和RNAIII间的重复序列发生特异性的结合,从而调控葡萄球菌毒力因子的表达和生物被膜的形成。如能抑制AgrC蛋白的激酶活性，阻断其自身磷酸化，进而抑制其对反应调节因子AgrA的磷酸化，则能有效阻断agr信号通路，减少毒力因子的表达，降低葡萄球菌的致病性。因此以agr系统作为治疗葡萄球菌的药物靶点，开发新型抗菌药物，对于攻克葡萄球菌的致病性和耐药性具有重要的意义。然而，从众多的单体化合物中筛选出对AgrC蛋白的激酶活性具有特异性抑制作用的药物异常艰难。一方面，生物膜组分高度复杂，在原位考察药物单体对AgrC蛋白的作用效果较为困难；另一方面，多种膜组分的存在影响到对药物单体确切作用靶点的判断。因此，急需寻找一种高通量、特异性强、操作便捷的实验方法用于筛选对组氨酸激酶AgrC具有特异抑制活性的药物单体化合物。近年来出现的蛋白脂质体为在生物体系外研究膜蛋白的结构与功能提供了有效平台，现已成功应用到许多膜蛋白结构和功能的研究中,如肌浆网中的ATP激酶,粪肠球菌的感受激酶等。目前，组氨酸激酶AgrC蛋白脂质体的研究主要集中在蛋白脂质体的构建方面，王丽娜等将金黄色葡萄球菌AgrC蛋白的第6和第7两个跨膜区AgrCTM6-7C蛋白截取出来，构建了AgrCTM6-7C蛋白脂质体(PLoSONE,2013,8(11):e80400)；张旭宁等则以金黄色葡萄球菌全长的AgrC蛋白为基础，构建了AgrC蛋白脂质体(张旭宁,大连工业大学硕士论文,2015)。但以AgrC蛋白脂质体为基础构建药物筛选模型，并成功筛选出对AgrC蛋白的激酶活性具有较强抑制作用的药物单体化合物还未见报道。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术的第一个目的是，以AgrC蛋白脂质体为基础，构建以组氨酸激酶AgrC为靶点的药物筛选模型。本专利技术的第二个目的是，从14种中药单体化合物中筛选出对组氨酸激酶AgrC的激酶活性具有较强抑制作用的药物单体化合物。一种以组氨酸激酶AgrC为靶点的药物筛选模型，是按照如下方法构建的：(1)采用常规膜蛋白的制备方法对AgrC蛋白进行提取与纯化将携带pET-28a-AgrC重组质粒的大肠杆菌(Escherichiacoli)。经摇床培养、诱导表达、冰上摇床孵育后，低温超高压破碎收集细胞膜沉淀。分离得到AgrC蛋白粗提液，经金属离子螯合层析、尺寸排阻层析得到AgrC蛋白纯品。(2)对纯化后的AgrC蛋白进行定量检测，以确定其浓度根据上海生工BCA法蛋白浓度测定试剂盒的说明书定量检测纯化后的AgrC蛋白。(3)以二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)和1,2-二软脂酰基-sn-甘油基-3-膦钠盐(DPPA)两种磷脂以及胆固醇(CHOL)为原料制备脂质体。(4)利用表面活性剂介导的方法将提取并纯化后的AgrC蛋白镶嵌到脂质体中形成蛋白脂质体，并测定蛋白脂质体中AgrC蛋白的激酶活性。所述的表面活性剂为本领域常规的试剂，如十二烷基聚乙二醇醚(Brij-35),十二烷基二甲基氧化胺(LDAO),FOS-维生素B-12(FOS)。(5)构建以组氨酸激酶AgrC为靶点的药物筛选模型，并对药物筛选模型进行评价根据AgrC蛋白能够发生自我磷酸化的特性构建药物筛选模型。AgrC蛋白作为组氨酸激酶可通过其自身的激酶活性域催化磷酸基从ATP向其自身的组氨酸残基转移。当反应结束后，体系中剩余的ATP与甲壳荧光素发生反应，形成氧化荧光素发出荧光。向上述体系中加入的药物单体化合物如能与AgrC蛋白发生作用，则会影响其激酶活性，从而使体系发光情况发生改变。依此原理构建药物筛选模型，可以用于AgrC蛋白酶活抑制剂的筛选。考察溶剂、缓冲液、空白脂质体等条件对药物筛选模型的影响。(6)对组氨酸激酶AgrC具有较强抑制活性药物单体化合物的筛选将待筛选药物单体化合物添加到上述药物筛选模型中，根据体系荧光强度的变化计算药物单体化合物对AgrC蛋白的激酶活性抑制率。根据抑制率的大小筛选出对组氨酸激酶AgrC蛋白具有较强抑制作用的药物单体化合物。以等体积的空脂质体代替蛋白脂质体作为阳性对照组，以等体积的DMSO代替药物单体化合物作为阴性对照组，以等体积的空脂质体及等体积的DMSO分别代替蛋白脂质体和药物单体化合物作为空白对照组，测定各组荧光值；根据荧光值计算酶活抑制率，计算公式如下：酶活抑制率＝[1-(LP-LY/LK-LN)]×100％；(A)其中：LY代表样品实验组的荧光值；LP代表阳性对照组的荧光值；LN代表阴性对照组的荧光值；LK代表空白对照组的荧光值。本专利技术同时请求保护保护大黄素、芦荟大黄素、葛根素和芹菜素在抑制AgrC蛋白的激酶活性中用途。本专利技术的有益效果如下：(1)本专利技术构建的药物筛选模型，适用于筛选对组氨酸激酶AgrC具有较强抑制效果的药物单体化合物，筛选出的化合物作用位点明确。(2)在96孔板中，采用此药物筛选模型对药物单体化合物的筛选具有高通量、特异性强、操作便捷等优点。(3)本专利技术中脂质体重构的过程并不仅仅局限于AgrC蛋白，其它具有激酶活性的膜蛋白同样可以通过这一方法进行重构，从而构建出以不同膜蛋白受体为靶点的药物筛选模型。附图说明图1为AgrC蛋白SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析图；图2为AgrC蛋白脂质体激酶活性测定结果；图3为HEPES对药物筛选模型中AgrC蛋白激酶活性的影响；图4为DMSO对药物筛选模型中AgrC蛋白激酶活性的影响；图5为空脂质体对药物筛选模型中AgrC蛋白激酶活性的影响；图6为14种中药单体化合物对组氨酸激酶AgrC的酶活抑制率。其中：T-1、大黄酸，T-2、芦荟大黄素，T-3、葛根素，T-4、芹菜素，T-5、苦参碱，T-6、黄芩苷，T-7、绿原酸，T-8、柴胡皂苷A，T-9、水飞蓟素，T-10、木犀草苷，T-11、甜菜碱，T-12、黄芪甲苷，T-13、盐酸小檗碱，T-14、粉防己碱。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术的技术方案作进一步的说明，但本专利技术不以任何形式受限于实施例内容。实施例中所述试验方法如无特殊说明，均为常规方法；如无特殊说明，所述试剂和生物材料，均可从商业途径获得。大肠杆菌菌株购于Novagen公司，大肠杆菌菌株BL21(DE3)，Tuner(DE3)，C41(DE3)，C43(DE3)，BL21(DE3)-pLysS和BL21-CodonPlus(DE3)-RIL任意一种均用于AgrC蛋白的表达，优选C43(DE3)。选择六种大肠杆菌作为宿主对AgrC蛋白进行表达的目的是为了考察哪种菌株对AgrC蛋白的表达量最高本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种以组氨酸激酶AgrC为靶点的药物筛选模型，其特征在于，是按照如下方法构建的：(1)提取与纯化AgrC蛋白；(2)确定AgrC蛋白的浓度；(3)以二油酰磷脂酰胆碱、1,2‑二软脂酰基‑sn‑甘油基‑3‑膦钠盐、胆固醇为原料制备脂质体；二油酰磷脂酰胆碱、1,2‑二软脂酰基‑sn‑甘油基‑3‑膦钠盐、胆固醇的摩尔数比为2:2:1；(4)利用表面活性剂介导的方法将提取并纯化后的AgrC蛋白镶嵌到脂质体中形成蛋白脂质体，并测定蛋白脂质体中AgrC蛋白的磷酸激酶活性；(5)构建以组氨酸激酶AgrC为靶点的药物筛选模型：S5.1：AgrC蛋白作为组氨酸激酶可通过其自身的激酶活性域催化磷酸基从ATP向其自身的组氨酸残基转移，当反应结束后，体系中剩余的ATP与甲壳荧光素发生反应，形成氧化荧光素发出荧光；S5.2：向S5.1体系中加入待筛选的药物单体化合物，若体系发光情况发生改变，则该药物单体化合物对组氨酸激酶AgrC有抑制作用；S5.3：以等体积的空脂质体代替蛋白脂质体作为阳性对照组，以等体积的二甲基亚砜代替药物单体化合物作为阴性对照组，以等体积的空脂质体及等体积的二甲基亚砜分别代替蛋白脂质体和药物单体化合物作为空白对照组，测定各组荧光值；根据荧光值计算酶活抑制率，计算公式如下：酶活抑制率＝[1‑(LP‑LY/LK‑LN)]×100％；其中：LY代表样品实验组的荧光值；LP代表阳性对照组的荧光值；LN代表阴性对照组的荧光值；LK代表空白对照组的荧光值。...

【技术特征摘要】
1.一种以组氨酸激酶AgrC为靶点的药物筛选模型，其特征在于，是按照如下方法构建的：(1)提取与纯化AgrC蛋白；(2)确定AgrC蛋白的浓度；(3)以二油酰磷脂酰胆碱、1,2-二软脂酰基-sn-甘油基-3-膦钠盐、胆固醇为原料制备脂质体；二油酰磷脂酰胆碱、1,2-二软脂酰基-sn-甘油基-3-膦钠盐、胆固醇的摩尔数比为2:2:1；(4)利用表面活性剂介导的方法将提取并纯化后的AgrC蛋白镶嵌到脂质体中形成蛋白脂质体，并测定蛋白脂质体中AgrC蛋白的磷酸激酶活性；(5)构建以组氨酸激酶AgrC为靶点的药物筛选模型：S5.1：AgrC蛋白作为组氨酸激酶可通过其自身的激酶活性域催化磷酸基从ATP向其自身的组氨酸残基转移，当反应结束后，体系中剩余的ATP与甲壳荧光素发生反应，形成氧化荧光素发出荧光；S5.2：向S5.1体系中加入待筛选的药物单体化合物，若体系发光情况发生改变，则该药物单体化合物对组氨酸激酶AgrC有抑制作用；S5.3：以等体积的空脂质体代替蛋白脂质体作为阳性对照组，以等体积的二甲基亚砜代替药物单体化合物作为阴性对照组，以等体积的空脂质体及等体积的二甲基亚砜分别代替蛋白脂质体和药物单体化合物作为空白对照组，测定各组荧光值；根据荧光值计算酶活抑制率，计算公式如下：酶活抑制率＝[1-(...

【专利技术属性】
技术研发人员：权春善，张丽影，陈莹，刘爽，熊文，范圣第，
申请(专利权)人：大连民族大学，
类型：发明
国别省市：辽宁;21