【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种用于抗流感病毒药物筛选模型与方法及应用,特别涉及一种流感病毒RNA聚合酶抑制剂筛选模型及其应用。
技术介绍
甲流感与禽流感是目前严重威胁人类生命健康的急性呼吸道传播性疾病。随着疫 苗和药物的广泛使用,抗原变异株和耐药株的出现,使疫苗的保护效力和目前抗流感药物 的治疗效果显著降低,因此开发出新型的抗流感病毒药物迫在眉睫。甲型流感病毒属于正 粘病毒科(Orthomyxoviridae),甲型流感病毒属。目前已发现16种HA亚型和9种NA亚 型。甲型流感病毒RNA聚合酶是负责流感病毒RNA复制、转录等生物学功能的多亚基、多 功能酶,在流感病毒的生活周期中发挥着极其重要的作用。甲型流感病毒的RNA聚合酶是 由由2个碱性亚基PB1、PB2和1个酸性亚基PA组成的复合物。在病毒体内,3个RNA聚合 酶亚基与NP蛋白、RNA形成较为紧密的RNP复合物。甲型流感病毒RNA聚合酶是一个多功 能酶,不仅具有RNA聚合酶活性(转录酶和复制酶),还有RNA核酸酶活性(内切酶和外切 酶)。流感病毒的RNA聚合酶可直接从宿主细胞内的mRNA上剪切加帽的RNA引物(capped RNA primer)来启动合成自身的mRNA。因此,流感病毒与高等生物转录后需加上帽子结 构不同,流感病毒mRNA转录后不再需要加帽的引物,直接先以vRNA为模板合成出其互补 RNA (cRNA),然后再以cRNA为模板复制出vRNA。综上所述,流感病毒RNA聚合酶是一个多功 能酶,既是转录酶又是复制酶,同时在转录过程中,具有切割宿主mRNA帽子结构的核酸内 切酶活性,又有发挥校对作用的核 ...
【技术保护点】
一种抗流感病毒药物筛选模型,其特征在于按如下步骤制备: A、通过将含甲型流感病毒4个RNA聚合酶相关基因(PB1、PB2、PA和NP)分别插入pHW2000双向转录真核表达载体BsmBI酶切位点,构建具有流感病毒RNA聚合酶活性的真核质粒pHWPB2、pHWPB1、pHWPA和pHWNP; B、按如下引物PCR扩增报告基因反向插入上述pHW2000载体的BsmBI酶切位点, 引物F1: 5’-ATACGTCTCGGGG AGCAAAAGCAGGGTAGATAATCACTCACCGAGTGACATCAACACCATGGTGAGCAAGGGCGAGG-3’ 引物F2: 5’-ATACGTCTCATATTAGTAGAAACAAGGGTATTTTTCTTTACTTGTACAGCTCGTCC-3’,如何插入pHW2000载体的BsmBI酶切位点 C、将上述质粒按任意比例,利用脂质体转染试剂,按转染试剂说明共转染真核细胞293T细胞,,转染后0-24h在转染后的真核细胞293T细胞中加入待检测药物,培养12-36h后,以不加待测药物的细胞转染组为对照,利用荧光显微镜或相应检测试剂观 ...
【技术特征摘要】
一种抗流感病毒药物筛选模型,其特征在于按如下步骤制备A、通过将含甲型流感病毒4个RNA聚合酶相关基因(PB1、PB2、PA和NP)分别插入pHW2000双向转录真核表达载体BsmBI酶切位点,构建具有流感病毒RNA聚合酶活性的真核质粒pHWPB2、pHWPB1、pHWPA和pHWNP;B、按如下引物PCR扩增报告基因反向插入上述pHW2000载体的BsmBI酶切位点,引物F15’-ATACGTCTCGGGGAGCAAAAGCAGGGTAGATAATCACTCACCGAGTGACATCAACACCATGGTGAGCAAGGGCGAGG-3’引物F25’-ATACGTCTCATATTAGTAGA...
【专利技术属性】
技术研发人员:张评浒,张陆勇,
申请(专利权)人:中国药科大学,
类型:发明
国别省市:84[中国|南京]
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