一种快速高通量抗病毒药物筛选模型制造技术

针对普通体外高通量筛选的不确定性和不对应性等缺陷，本发明专利技术提供了一种新型的高通量筛选模型的建立方法，最大限度的模拟动物体内生理环境，增加了药物筛选的准确性，使体外筛选的结果更接近临床应用效果。本发明专利技术的技术方案为：通过动物体内循环对药物吸收分离药物有效成分的方法提取动物含药血清，使药物经过体内代谢过程后再加到细胞培养液或维持液中，结合微量细胞培养法、细胞病变（ＣＰＥ）测定和ＭＴＴ法计算细胞活性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及药物筛选模型领域，具体涉及一种抗病毒药物的快速高通量筛选模型 的建立方法，可应用于药物的筛选。
技术介绍
药物蹄选模型(drug screening model，drugscreening assay method)是用于证 明某种物质具有药理活性(生物活性、治疗作用)的实验方法，这些实验方法是寻找和发现 药物的重要条件之一。人们在长期寻找药物的实践过程中，建立了大量用于新药筛选的各 类模型，大致分为经典的动物实验法、分子生物学筛选法、高通量药物筛选法和高内涵药物 筛选技术。所谓动物筛选法就是以动物作药物筛选的观察对象，以动物对药物的反应，证明 某些物质的药理作用，评价其药用价值。单纯从新药筛选的角度看，动物筛选模型的最大优 点是可以从动物身上直观地反应出药物的治疗效果、不良反应以及毒副作用。由动物模型 获得的筛选结果，对预测被筛选样品的临床效果、毒副作用和应用前景具有十分重要的价 值。但动物筛选法也存在缺点采用动物模型进行药物筛选时，由于动物的特殊性，决定了 药物筛选过程主要依赖于手工操作，而且只能对有限的样品进行筛选，使整体动物模型筛 选新药具有明显的局限性，效率低、成本高、动物实验需要时间长、劳动强度大、操作技术要 求高、受试样品需要量大(约5g)。分子生物学筛选方法近20年来，许多药物作用的受体已被分离、纯化，一些基因 的功能及相关调控物质被相继阐明，为药物筛选提供了许多新的靶点，这就使得药物筛选 模型从传统的整体动物、器官和组织水平发展到细胞和分子水平。分子生物学为药物筛选 提供了新型靶蛋白，对人工合成的组合化学库和小分子肽库进行目的性药物筛选。通过比 较健康人群与患者间在机体组织细胞分子上的差异以及阐明模型组织中相应蛋白质的功 能，从而正确地选择、描述并确认某些靶蛋白，这有助于更加理性和有目的性地进行药物筛 选。生化水平的药物筛选拟用开发药物作用的靶点设计实验，一般而言这种作用靶点是具 有某种特定生理功能的蛋白质，如酶和受体等，此外一些编码功能明确的DNA也越来越多 地成为药物作用的新靶点。候选化合物与靶点混合后，可以通过酶联免疫、荧光显色、核磁 共振等方法定量测定化合物与靶点的相互作用，从而成为筛选化合物的依据。生化水平的 药物筛选操作相对简单，成本较低，但是由于药物在体内的作用并不仅仅取决于其与靶酶 的作用程度，吸收、分布、代谢、排泄均会对药物的作用产生极大的影响，仅仅一道薄薄的细 胞膜就能够阻挡住许多候选化合物，因而生化水平的药物筛选不确定因素更多，误筛率较 高。此外，该筛选方法手段单一、费时耗财也成为其无法深入发展的缺陷。高通量药物筛选(high throughput screening, HTS)是20世纪80年代后期形 成的寻找新药的高新技术。采用的筛选方法一般是以药物作用靶点为主要对象的细胞和分 子水平的筛选模型，根据样品与靶点结合的表现，判断化合物的生物活性。由于这些筛选方 法在微量条件下进行，同时采用自动化操作系统，可以进行大规模的筛选，因而称为高通量药物筛选。高通量筛选依赖数量庞大的样品库，实现了药物筛选的规模化，较大限度地利用 了药用物质资源，提高了药物发现的概率，同时提高了发现新药的质量，充分利用了药用资 源。高通量筛选采用的是细胞、分子水平的筛选模型，筛选实验是在微量筛选系统中完成 的，样品用量一般在微克级(g)，节省了样品资源，奠定了“一药多筛”的物质基础，同时节省 了实验材料，降低了单药筛选成本。而且高通量药物筛选为高度自动化操作，不但减少了操 作误差的发生，降低了劳动强度，而且提高了药物筛选的效率和结果的准确性。但是，高通 量筛选所采用的主要是分子、细胞水平的体外实验模型，任何模型都不可能充分反映药物 的全面药理作用；用于高通量筛选的模型总是有限的，要建立反映机体全部生理机能或药 物对整个机体作用的理想模型，也是不现实的。高内涵筛选是指在保持细胞结构和功能完整性的前提下，同时检测被筛样品对细 胞形态、生长、分化、迁移、凋亡、代谢途径及信号转导各个环节的影响，在单一实验中获取 大量相关信息，确定其生物活性和潜在毒性的一种药物筛选方法。从技术层面而言，高内涵 筛选是一种应用高分辨率的荧光数码影像系统，在细胞水平上检测多个指标的多元化、功 能性筛选技术，旨在获得被筛样品对细胞产生的多维立体和实时快速的生物效应信息；从 筛选载体上看，高内涵药物筛选与高通量药物筛选并没有显著的区别，也是在微孔板上进 行的，目前使用较多的是96孔微板。高内涵药物筛选的检测体积并未因检测指标增加而增 高，操作步骤同样简单可行、自动化。虽然高通量药物筛选的结果较为准确，易于评价，但 其检测模型均建立在单个药物作用靶分子的基础上，无法全面反映被筛样品的生物活性特 征。以现代分子和细胞生物学为基础建立的快速、微量、定向的体外筛选模型和测试 方法，以及结合自动化技术发展起来的高通量筛选技术是目前创新药物的研究重要手段。 药物的药理作用是通过肌体细胞或病原体的药物靶点而发挥，内用药物无论是经过口服、 注射等任何一种给药途径，都需经过吸收、代谢、分布和排泄的过程，这些过程都影响药物 的效果，如代谢通过氧化、分解、结合等影响药物的分子结构和作用效果，过程相当复杂，有 的使药效降低或消失，如氯丙嗪、磺胺药等；有的使药效增强，如无活性的抗癌药物硫唑嘌 呤经过代谢变成具有药理活性的6-硫基嘌呤。常规体外细胞或病原体培养药物筛选模型， 因药物未经过体内吸收、分布、代谢等过程，而是直接作用于细胞或病原体；因此不能真正 的反映药物的作用，存在不确定性和不对应性，有些在体外实验有效的药物或药物成分，在 临床实验上却无效。通常体外药物筛选的结果与临床效果存在很大的偏差；同时常规体外 细胞培养药物筛选模型需先对每种药物进行培养细胞的安全用量测定，工作量大，操作复 杂，成本高等缺陷。
技术实现思路
针对普通体外高通量筛选的不确定性和不对应性等缺陷，本专利技术提供了一种新型 的高通量筛选模型的建立方法，最大限度的模拟动物体内生理生化环境与过程，提高了药 物筛选的准确性。本专利技术的技术方案包括如下步骤(1)给每只试验动物灌服最大安全剂量药物，分离制备含药血清或血浆备用；(2)按常规方法制备正常试验动物血清或血浆，测试其血清或血浆对细胞的影响，得出动物血清或血浆对细胞系培养的最大安全浓度；(3)以动物血清的最大安全浓度量为标，将含药血清或血浆加入细胞培养液或细 胞维持液中培养，作CPE测定和MTT法测定，评价药物效果，筛选出有效药物。本专利技术中所说的最大安全剂量是指给某一种动物一次灌服药物最多，但不致动物 死亡的剂量。最大耐受剂量(maximal tolerance dose，MTD或LD0或LC0)指某实验总 体的一组受试动物中不引起动物死亡的最大剂量。毒理学中，最大耐受剂量(maximal tolerance dose，MTD或LD0或LC0)指某实 验总体的一组受试动物中不引起动物死亡的最大剂量。本方法的原理是测定某一试验动物(小鼠、大鼠、豚鼠、犬、猫、猪、兔、禽等)血 清(血浆)对培养细胞系的安全使用浓度，并建立细胞系微量培养方法；将药物经试验动物 服用，进行吸收、分布与代谢，提取动物含药血清(血浆)，以本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速高通量药物筛选模型，其特征在于包括如下步骤：（１）给每只试验动物灌服最大安全剂量药物，分离制备含药血浆或血清备用；（２）按常规方法制备正常试验动物血清或血浆，测试其血清（血浆）对细胞的影响，得出动物血清（血浆）对细胞系培养的最大安全浓度；（３）以动物血清的最大安全浓度量为标，将含药血清或血浆加入细胞培养液或细胞维持液中培养，作ＣＰＥ测定和ＭＴＴ法测定，评价药物效果，筛选出有效药物。

【技术特征摘要】
一种快速高通量药物筛选模型，其特征在于包括如下步骤(1)给每只试验动物灌服最大安全剂量药物，分离制备含药血浆或血清备用；(2)按常规方法制备正常试验动物血清或血浆，测试其血清(血浆)对细胞的影响，得出动物血清(血浆)对细胞系培养的最大安全浓度；(3)以动物血清的最大安全浓度量为标，将含药血清或血浆加入细胞培养液或细胞维持液中培养，作C...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖兵南，
申请(专利权)人：肖兵南，
类型：发明
国别省市：43[中国|湖南]