白细胞介素-1受体拮抗剂的细胞内同种型制造技术

本发明专利技术叙述一种新的对ＩＬ－１ａ和ＩＬ－１Ｂ两者均有拮抗活性的白细胞介素－１，一种编码此ＩＬ－１拮抗剂的新ＤＮＡ序列和用重组ＤＮＡ技术获得ＩＬ－１拮抗剂的方法；也叙述了这种新ＩＬ－１拮抗剂在由于ＩＬ－１的产生而引起的病理的预防，治疗和诊断中的用途。（*该技术在2015年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本专利技术为生物
它叙述一种对IL-1a和IL-1B两者均有活性的白细胞介素-1(IL-1)新拮抗剂，一种编码IL-1拮抗剂的新的DNA序列和以DNA重组技术获得IL-1拮抗剂的方法。它也叙述这种IL-1新拮抗剂在由于IL-1的产生而导致的病理方面的预防，治疗和诊断的用途。
技术介绍
有两种截然不同的白细胞介素-1编码基因命名为IL-1a和IL-1B，它们分别编码IL-1a蛋白质和IL-1B蛋白质。白细胞介素IL-1a和IL-1B为多效性的细胞因子，它们虽然在序列上显示很少的相似性，但对不同的组织和对人类的许多病理，特别是在组织的免疫应答和炎症的过程产生种种相似的效用。两种蛋白质具有的分子量约为17.5KDa，并均曾以具有分子量约为31KDa的较大的前体分子在以前合成过。IL-1为强的炎症和致热的细胞因子，通常对组织具有有利的作用但也能有极为不良的作用。例如它们能够参与自体免疫病理症状的发病机制，如红斑狼疮和特别是例如在风湿性关节炎中它们做为介质对组织造成损害。IL-1的许多生理效应和那些在脓毒症过程中所观察到的相似。近来的研究表明IL-1以1至10ng/kg剂量静脉给药可引起发热、困倦、厌食、周身性肌痛，关节痛和偏头痛。因为IL-1具有多效性的生理活性，许多生理活性对组织产生负性影响，所以IL-1的强效力必须在严格地生理控制之下。IL-1的合成被抗炎的细胞介质、前列腺素和糖皮质激素所抑制，同时IL-1多水平抑制作用的存在对严格控制此介质是需要的。IL-1是到现在为止所叙述过的受体多肽拮抗剂中仅有的一种细胞因子IL-1族至今第三个已知成份是IL-1受体(IL-1ra)的拮抗剂。所有三种组分(IL-1a，IL-1B，IL-1ra)均能识别并与细胞表面上的同一受体(IL-1R)结合IL-1a和IL-1B结合在IL-1R上可传递信号而IL-1ra则不能。有两种类型的IL-1受体，称为IL-1R I和IL-1R II。IL-1ra为一种多肽，它结合于IL-1R I而与IL-1R II的亲和力弱，没有激动活性。IL-1ra在不同的细胞类型中，包括单核吞噬细胞，多形核细胞(PMN)和成纤维细胞，被IgG、细胞因子和细菌产物诱导产生。至今有两种IL-1ra的分子形式已被鉴定和克隆1)分泌的IL-1ra(sIL-1ra)含有一个25个氨基酸的典型前导序列，给出一种152个氨基酸的成熟蛋白质；2)细胞内IL-1ra(icIL-1ra)缺乏一个前导序列，因此预示此蛋白质存留于细胞内。sIL-1ra和icIL-1ra由相同的基因产生。icIL-1ra转录物从两者之一的起始点和从剪接到位于sIL-1ra的第一个外显子中的内部剪接接受位点的第一个供选择的外显子产生。因此，预计的蛋白质除它们的NH2末端外是等同的，在该末端sIL-1ra的前21个氨基酸在icIL-1ra中被四个氨基酸所替代。sIL-1ra和icIL-1ra转录编码的表达受不同的调控。icIL-1ra的生物显著性仍不清楚。考虑到IL-1涉及到许多疾病的病理，用于限制IL-1不良效应的可购得的药物的需要是明显的。本专利技术的概要本专利技术的一个目的是提供对IL-1a和IL-1B及它们的组合有活性的一种IL-1拮抗剂。本专利技术的进一步的目的是提供一种编码IL-1拮抗剂的DNA序列和用DNA重组技术获得这种新拮抗剂的方法。本专利技术的另一个目的是提供实质上纯化形式的拮抗剂以适合用于在需要抑制IL-1病理时有活性的药物组合物。本专利技术的其余目的和有利之处将在下列的叙述中表明。附图和序列表的扼要说明附图说明图1叙述icIL-1ra II(SEQ ID NO8和SEQ ID NO9)的DNA序列和蛋白质序列与典型的sIL-1ra(icIL-1ra ISEQ ID NO6)和sIL-1ra(SEQ ID NO4和SEQ ID NO5)相比较非共同的部分，它也叙述IL-1ra共同部分(SEQ ID NO13和SEQ ID NO14)的DNA序列和编码的蛋白质。图2叙述icIL-1ra II在不同细胞类型中表达的RT-PCR分析。图3叙述重组的icIL-1ra II Western印迹分析。图4叙述icIL-1ra II对内皮细胞中IL-1诱导的E-选择蛋白表达的效用。SEQ ID NO1报道用于RT-PCR中称为IRA5寡核苷酸的序列。SEQ ID NO2报道相当于用于RT-PCR中的B-肌动蛋白cDNA69-70核苷酸的寡核苷酸序列。SEQ ID NO3报道用于RT-PCR反向互补于430-449核苷酸的寡核苷酸序列。SEQ ID NO4报道编码sIL-1ra非共同部分的DNA序列。SEQ ID NO5报道sIL-1ra非共同部分的氨基酸序列。SEQ ID NO6报道编码icIL-1ra I非共同部分三个氨基酸的DNA序列。SEQ ID NO7报道icIL-1-ra I非共同部分三个氨基酸。SEQ ID NO8报道编码icIL-1ra II非共同部分的DNA序列。SEQ ID NO9报道icIL-1ra II非共同部分的氨基酸序列。SEQ ID NO10报道编码IL-1ra共同部分的DNA序列。关于与序列制备的″Patentin EPO″程序有关的问题，为了容许第一个氨基酸编码为Glu并更为了避免在序列里面形成终止密码子，在序列的第一个位置上加上一个G核苷酸。SEQ ID NO11报道IL-1ra共同部分的氨基酸序列。SEQ ID NO12报道代表icIL-1ra II与其它IL-1ra非共同片段的21个氨基酸的序列。SEQ ID NO13报道编码完整的icIL-1ra II的DNA序列。SEQ ID NO14报道完整的icIL-1ra II的氨基酸序列。
技术实现思路
为了完成本专利技术的目的，本专利技术涉及对至少一种选自白细胞介素1a和白细胞介素1B具有拮抗活性的纯化蛋白质，所述的蛋白质具有如SEQ ID NO14所述的氨基酸序列。它是经过重组DNA技术得到的。本专利技术还涉及一种编码具有SEQ ID NO14所述氨基酸序列的IL-1拮抗剂的分离的DNA序列，以及一种具有SEQ ID NO13所述序列的分离的DNA序列。另外，本专利技术还涉及含有编码含有SEQ ID NO14所述的氨基酸序列的蛋白质的DNA序列的载体。还涉及编码所述的纯化蛋白质的DNA转染的细胞。这种细胞是哺乳动物细胞。本专利技术还涉及一种经过重组DNA技术得到IL-1拮抗剂的方法，包括(1)培养含有能生产所述的编码纯化蛋白质的DNA序列的宿主细胞；(2)收集和分离编码过的蛋白质。在上述的方法中，所述的DNA序列是SEQ ID NO13。此新的IL-1拮抗剂是在编码icIL-1ra的DNA框架中将新的63个碱基对(bp)序列嵌入icIL-1ra第一个特定的外显子与sIL-1ra的第一个外显子的内部受点之间产生的。通过RT-PCR实验，本专利技术者发现此新的转录物可在活化的单核细胞和成纤维细胞中和在多形核细胞(PMN)中表达。在COS细胞中的表达揭示此新的拮抗剂通常为细胞内的并在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)中具有的分子量(MW)大约为25KDa。此新重组体拮抗剂显示IL-1的抑制活性。为了明确和容易的原因，在本申请中，现本文档来自技高网...

【技术保护点】
对至少一种选自白细胞介素１ａ和白细胞介素１Ｂ的物质具有拮抗活性的纯化蛋白质；其含有如ＳＥＱＩＤＮＯ：１２所述的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
IT 1994-10-13 MI94A0020971.对至少一种选自白细胞介素1a和白细胞介素1B的物质具有拮抗活性的纯化蛋白质，其含有如SEQ ID NO12所述的氨基酸序列。2.纯化蛋白质在制备药物组合物中的用途，所述纯化蛋白质对至少一种选自白细胞介素1a和白细胞介素1B的物质具有拮抗活性，其特征在于所述纯化蛋白质具有如SEQ...

【专利技术属性】
技术研发人员：弗朗切斯科科洛塔，马尔塔穆齐奥，阿尔贝托曼托瓦尼，
申请(专利权)人：应用研究系统ARS股份公司，
类型：发明
国别省市：AN[]