一种培育高蛋白质含量粳稻的方法和分子标记技术

本发明专利技术属于植物生物学技术和基因工程技术领域，具体涉及一种培育高蛋白质含量粳稻的方法和分子标记。所述用于培育高蛋白质含量粳稻的分子标记，是鉴别水稻中qPC‑10基因座位上不同等位基因的分子标记G2，为CAPs标记，位于SEQ ID NO.1的第1455bp。该标记的引物序列如SEQ ID NO.17‑18所示，本发明专利技术还公开了一种利用所述分子标记培育高蛋白质含量粳稻的方法。本发明专利技术分子标记和配套方法，可以培育高蛋白质含量的粳稻品种，具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于植物生物学技术和基因工程
，具体涉及一种培育高蛋白质含量粳稻的方法和分子标记。
技术介绍
世界超过一半的人口利用稻米作为主要的粮食来源。近十年来，随着人们生活水平的不断提高，稻米品质受到越来越多的消费者关注。但是，我国稻米的品质则普遍偏低，在南方稻区大面积栽培的籼稻的品质普遍低于国标二级，而在北方栽培的粳稻的品质与日本品种也存在较大的差距。这一方面满足不了我国消费者对优质稻米的日益增长的消费需求，同时也严重影响了我国稻米在世界市场上的竞争力。因此，近十几年来，我国在水稻品种培育上，除了将高产作为主要目标外，稻米品质的提高已成为另一个十分重要的育种目标。优质稻米的理化指标包括营养品质、蒸煮食味品质、加工品质和外观品质等。经研究表明，稻米的组成及其结构决定了稻米的蒸煮和营养品质。稻米是由两大主要成分所组成：一是占90％左右的淀粉；二是稻米中蛋白质。目前对于淀粉的生物合成机制已经比较明确，参与合成淀粉的基因、以及各个基因之间的调控网络已经明晰。这些研究成果的取得为水稻淀粉品质的改良提供了有力的理论支撑。然而，决定稻米蒸煮和营养品质的另一个重要因子：蛋白质的遗传机理至今不是很明了。水稻胚乳蛋白质含量是典型的数量性状，具有比较复杂的遗传基础。利用分子标记技术可以对控制数量性状的QTL进行定位和分解，将复杂的数量性状分解为简单的孟德尔因子进行研究。近十几年来已经发现了许多控制水稻蛋白质含量的QTLs，而这些QTLs的定位还处于初级阶段。不同的研究者利用不同的材料在不同的环境中所定位的QTLs不尽相同，且很少有能被重复检测到。到目前为止，只有在第一条染色体长臂上编码氨基酸跨膜转运蛋白的qPC1已被成功克隆。因此，本专利技术克隆的qPC-10对于水稻品质性状的改良有巨大的应用潜力和前景，为水稻的品种育种提供新的重要基因资源。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种培育高蛋白质含量粳稻的方法和分子标记。本专利技术基于从水稻中分离克隆出的一个控制水稻胚乳蛋白质含量和品质的主效基因的完整编码区段DNA片段(这个基因命名为qPC-10)，利用这个基因来改良水稻品质为了便于识别携带控制稻米蛋白质含量qPC-10的基因型，在启动子+546bp的位置上设计一个能够鉴别qPC-10等位基因型的功能标记G2。本专利技术所采用的技术方案是：一种用于培育高蛋白质含量粳稻的分子标记，是鉴别水稻中qPC-10基因座位上不同等位基因的分子标记G2，该标记为CAPs标记，位于SEQ ID NO.1的第1455bp。所述qPC-10基因序列如SEQ ID NO.1所示，qPC-10基因所编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。上述分子标记G2引物序列为：F:5’-TGTGTCACGCCTAATACT-3’(SEQ ID NO.17)，R:5’-ATGAAAGAAGATGTGGTG-3’(SEQ ID NO.18)。利用上述分子标记进一步提供了一种鉴别水稻中qPC-10基因座位上不同等位基因的方法，是用序列如SEQ ID NO.17-18引物扩增待测水稻中qPC-10基因，扩增产物用限制性内切酶ClaI酶切，能够被限制性内切酶ClaI切开的携带有qPC-10粳型等位基因的片段，不能被切开的则携带qPC-10籼型等位基因的片段。更进一步，本专利技术还提供了一种培育高蛋白质含量粳稻的方法，具体为以待改良的粳稻品种与一个典型的籼稻品种杂交,再用粳稻品种连续回交。在回交后代中,用分子标记G2的两个引物(SEQ ID NO.17-.18)对回交群体中的个体基因组DNA进行PCR扩增，扩增的产物采用限制性内切酶ClaI酶切，如果其中一条带不能被切开，则该个体用于继续回交。按此法回交至5代以上，自交获得纯合个体，再用G2标记进行检测，获得在qPC-10座位上带有籼型等位基因的个体/品系。本专利技术对Sasanishiki/Habataki所衍生的CSSLs群体进行精米蛋白质含量的QTL分析，鉴定出含有qPC-10基因的材料，与Sasanishiki杂交并自交，构建qPC-10的分离群体，选择具有极端蛋白质含量的植株成功将qPC-10基因定位到第10号染色体上的LOC_Os10g26060处。该基因包含4个外显子，共编码499个氨基酸，通过生物信息学技术预测该蛋白质为谷蛋白。Real-Time PCR表达分析发现，该基因只在水稻籽粒中表达，且在胚乳中蛋白质含量高的品种(如Habataki)比蛋白质含量低的品种(如Sasanishiki)的表达量高。预测表达量其关键作用，于是利用PCR技术获得Habataki的克隆，亚克隆后，进行转基因CRISPR-Cas9干涉表达和互补转化实验验证，在CRISPR-Cas9干涉表达的T0代阳性植株中蛋白质含量存在降低，而互补转化T0代阳性单株均表现出胚乳蛋白质含量存在不同程度的升高。此外，利用稻米蛋白质含量高的品种(如Habataki)和蛋白质含量低的品种(如Sasanishiki)进行比较测序，发现在2Kb的启动子区和编码区范围内两品种存在7个共同的SNP和Indel差异，其中有6个突变位于启动子区，1个位于3’UTR编码非翻译区。利用PCR技术同时获得Habataki和Sasanishiki启动子区的克隆，构建GUS载体。结果表明在籽粒发育不同时期Habataki启动子的表达量均高于Sasanishiki启动子表达量。以上结果说明了启动子区的变异是导致表达量变化的原因，进而导致水稻胚乳中蛋白质含量的变化。本专利技术在水稻胚乳中克隆了一个对稻米蛋白质含量具有正调控效应的基因，这为水稻的优质育种提供了新的基因资源。附图说明图1 qPC-10基因的精细定位。图2 qPC-10候选基因LOC_Os10g26060的表达分析。图3 G2标记在Habataki和Sasanishiki品种中的检测带型。具体实施方式下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。本专利技术所设计的生物材料来源如下：Sasanishiki、Habataki、CSSL：引自日本国立遗传研究所，载体pCAMBIA1301：公开材料，该载体购自Takara公司载体p-MD18-T：公开材料，该载体购自Takara公司载体p1022：公开材料，该载体购自Takara公司大肠杆菌DH5α：公开材料，该载体购自Generay公司农杆菌EHA105：公开材料，该载体购自Takara公司。实施例1：精米蛋白含量的QTL定位1、稻米蛋白质含量表型的测量谷粒自然干燥后放在至于室温下至少3个月以上以保证谷粒的干燥和各株系间含水量相对一致。利用稻谷出糙机上脱壳得到糙米，将糙米在精米机上研磨成精米。在近红外快速分析仪上快速检测精米的蛋白质含量。2、利用单片段代换系鉴定精米蛋白质含量QTL2007-2008年，在3个不同环境中鉴定了典型籼稻品种Habataki和粳稻品种Sasanishiki的蛋白质含量，发现在不同的环境中其蛋白质含量均存在显著差异(表1)。在39个染色体单片段代换系群体中，精米蛋白质含量也分离显著。在2007年扬州，蛋白质含量变化范围为8.6％到11％；在2008年海南，变化范围为7.8％到9.4本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于培育高蛋白质含量粳稻的分子标记，其特征在于，是鉴别水稻中qPC‑10基因座位上不同等位基因的分子标记G2，该标记为CAPs标记，位于SEQ ID NO.1的第1455bp。

【技术特征摘要】
1.一种用于培育高蛋白质含量粳稻的分子标记，其特征在于，是鉴别水稻中qPC-10基因座位上不同等位基因的分子标记G2，该标记为CAPs标记，位于SEQ ID NO.1的第1455bp。2.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，该标记的引物序列为：F:5’-TGTGTCACGCCTAATACT-3’(SEQ ID NO.17)，R:5’-ATGAAAGAAGATGTGGTG-3’(SEQ ID NO.18)。3.一种鉴别水稻中qPC-10基因座位上不同等位基因的方法，其特征在于，用序列如SEQ ID NO.17-18引物扩增待测水稻中qPC-10基因，扩增产物用限...

【专利技术属性】
技术研发人员：严长杰，杨宜豪，郭旻，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32