本发明专利技术属于动物疾病诊断领域，具体涉及一种脑多头蚴病的标志物GP50以及用于诊断脑多头蚴病的试剂盒。脑多头蚴病间接ELISA诊断方法敏感性达95％、特异性达92.6％。人工感染多头带绦虫山羊的血清抗体监测发现在感染后的整个检测期GP50抗体值均呈现阳性。因此GP50重组蛋白可作为脑多头蚴病标志物，用于诊断脑多头蚴病。本发明专利技术所述脑多头蚴病的间接ELISA诊断试剂盒可以快速、灵敏、特异的用于诊断脑多头蚴病，为脑多头蚴病感染的早期的诊断及治疗效果的评价奠定基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于动物疾病诊断领域，具体涉及一种脑多头蚴病的标志物GP50以及用于诊断脑多头蚴病的试剂盒。
技术介绍
脑多头蚴病(Coenuriasis)又叫脑包虫病，是由多头带绦虫(Taenia multiceps)的中绦期幼虫脑多头蚴(Coenurus cerebralis)寄生于牛、羊等偶蹄动物的脑和脊髓等处引起的一种寄生虫病。该病呈世界性分布，常引起患病动物发生死亡，给畜牧业造成巨大经济损失，同时人也有感染的报道。多头蚴病的临床表现多样，而且在动物感染后的一段时间内不出现典型的临床症状，所以在感染早期难以确诊。多样的临床表现导致了临床诊断的复杂性和迫切需要更可靠的诊断工具。医学影像技术已经用于人脑多头蚴病的诊断，主要是应用MRI和CT扫描来识别人脑部的包囊。这些技术同样也可以用在动物脑多头蚴的诊断上，Manunta等(2012)研究了33只患慢性脑多头蚴病的绵羊和1只患病山羊的脑和头骨的MRI特征，提示患病绵羊和山羊颅腔形态异常，内含大量的包囊。由于检测结果的可信度高，MRI和CT扫描被认为是诊断人和动物脑多头蚴病最好的方法，但是这些先进的诊断方法不易在养殖场实施，检测成本非常昂贵，而且MRI和CT扫描技术成功应用的前提条件是脑多头蚴在中枢神经系统内定居并形成一定大小的包囊，所以此类技术并不能在感染的早期进行诊断。现代分子生物学技术已经用于脑多头蚴病的诊断，Ahmad Oryan等(2015)提取患脑多头蚴病的绵羊和山羊脑脊液DNA，以多头带绦虫线粒体基因COX1序列设计引物，建立了检测小型反刍动物脑多头蚴病的PCR诊断方法，研究表明多头带绦虫DNA存在于感染脑多头蚴的绵羊和山羊脑脑脊液中，能够被所建立的PCR诊断方法所扩增。该诊断方法具有较高的准确性，但抽取动物的脑脊液操作烦琐，且不能进行早期诊断。传统的血清学诊断技术已经用于脑多头蚴病的早期诊断，目前已经建立了诊断多头蚴病的ELISA、Dot-ELISA、间接血凝试验(IHA)及斑点免疫金渗滤试验(DIGFA)等方法，这些方法都具有较好的诊断效果，但其所用抗原为虫体包囊液或原头蚴等天然虫体抗原，限制了此类方法在生产上的推广及使用。GPI锚定蛋白是一类依赖糖基磷脂酰肌醇(Glycosyl Phosphatidyl Inositol,GPI)锚定连接在真核生物细胞膜表面的一类蛋白质。GPI锚定蛋白在许多生物进程中扮演着重要作用。Hancock等(2004)研究表明猪带绦虫GP50蛋白是一个GPI锚定在细胞膜表面的猪囊尾蚴的诊断蛋白，并成功建立了基于重组GP50蛋白检测猪的猪囊尾蚴感染血清Western-blot方法。近年来，针对猪和人的猪囊尾蚴病已经建立了基于GP50重组蛋白的FAST-ELISA(Falcon assay screening test–enzyme-linked immunosorbent assay，FAST-ELISA)和QuickELISA诊断方法，其敏感性和特异性均较高，证实了GP50重组蛋白在猪囊尾蚴病上的诊断价值，但未见关于脑多头蚴GP50(TmGP50)蛋白的相关研究报道。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的是针对现有技术的问题，提供一种脑多头蚴病的标志物以及用于诊断脑多头蚴病的试剂盒。申请人采用多头带绦虫GP50重组蛋白作抗原，建立了检测山羊脑多头蚴病的间接ELISA诊断方法，其敏感性为95％，特异性为92.6％，能够在感染后第2周检测出山羊血清抗体阳性，与现有方法相比具有更早的检出时间(提前7天)。此外，药物治疗组山羊在肌肉注射吡喹酮后约3周呈现血清抗GP50抗体阴性，一直持续至整个试验结束。表明GP50重组蛋白可用于脑多头蚴病的诊断以及药物治疗后的效果评价。因此本专利技术提供了GP50重组蛋白制备脑多头蚴病标志物中的应用。本专利技术还提供了GP50重组蛋白在制备脑多头蚴病诊断试剂盒中的应用。所述诊断试剂盒包括但不限于间接ELISA诊断试剂盒。本专利技术所述应用中所述脑多头蚴病的受检样品可以采用本领域技术人员公知的任何一种样品，包括但不限于血液、唾液、尿液。优选的，所述脑多头蚴病的受检样品为血清或血浆。本专利技术所述GP50重组蛋白为GP50基因与表达载体连接后获得的重组质粒在宿主细胞中诱导表达的蛋白。在一些实施方案中，所述GP50重组蛋白的制备方法具体为提取山羊脑多头蚴总RNA，RT-PCR技术扩增GP50基因，构建pET-32a-GP50表达载体并诱导表达的蛋白。本专利技术所述表达载体可以采用本领域技术人员公知的任何一种表达载体，如pGEX系列载体、pET系列载体等。优选的，所述表达载体为pET32a(+)为pET32a(+)。本专利技术所述宿主细胞优选为大肠杆菌。本专利技术还提供了一种脑多头蚴病的间接ELISA诊断试剂盒，包括GP50重组蛋白。在一些实施方案中，本专利技术所述试剂盒还包括间接ELISA反应常用试剂。如PBST洗液、TMB显色液、反应终止液等。进一步的，在一些实施方案中，本专利技术所述试剂盒还包括对照品和标准品。由上述技术方案可知，本专利技术提供了一种脑多头蚴病的标志物以及用于诊断脑多头蚴病的试剂盒。以GP50重组蛋白为抗原建立的间接ELISA诊断方法敏感性达95％、特异性达92.6％，与山羊细颈囊尾蚴血清和绵羊细粒棘球蚴血清存在交叉反应。人工感染多头带绦虫山羊的血清抗体监测发现在感染后的整个检测期(2-17周)GP50抗体值均呈现阳性。因此GP50重组蛋白可作为脑多头蚴病标志物，用于诊断脑多头蚴病。本专利技术所述脑多头蚴病的间接ELISA诊断试剂盒可以快速、灵敏、特异的用于诊断脑多头蚴病，为脑多头蚴病感染的早期的诊断及治疗效果的评价奠定基础。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1示GP50基因PCR扩增产物电泳图，其中，泳道M为DL2000DNA Marker，泳道1为PCR产物；图2示以多头带绦虫GP50氨基酸序列构建的进化树(NJ树)；图3示重组质粒pMD19-T-GP50的酶切鉴定图，其中，泳道M为DL2000DNA Marker；泳道1为重组质粒pMD19-T-GP50经BamH Ⅰ和Xho Ⅰ酶切产物；图4示重组蛋白的SDS-PAGE图，其中，泳道M为蛋白Marker；泳道1为IPTG诱导的pET32a(+)空载体；泳道2为IPTG诱导的pET32a(+)-GP50质粒；泳道3为未经IPTG诱导的pET32a(+)-GP50质粒；图5示GP50重组表达蛋白的免疫印迹分析结果图，其中，泳道M为蛋白Marker；泳道1为山羊脑多头蚴阳性血清；泳道2为阴性对照血清；图6示间接ELISA诊断方法的敏感性和特异性检测，其中粗体水平线表示cut-off值(0.581)；图7示人工感染多头带绦虫山羊血清抗GP50抗体规律监测图，其中粗体水平线表示cut-off值(0.581)。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护本文档来自技高网...
【技术保护点】
GP50重组蛋白在制备脑多头蚴病标志物中的应用。
【技术特征摘要】
1.GP50重组蛋白在制备脑多头蚴病标志物中的应用。2.GP50重组蛋白在制备脑多头蚴病诊断试剂盒中的应用。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述脑多头蚴病的受检样品为血清或血浆。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述GP50重组蛋白为GP50基因与表达载体连接后获得的重组...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨光友，黄兴，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：四川;51
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