本发明专利技术涉及一种检测鲤IGF2a基因单核苷酸多态性的方法及引物，通过鲤IGF2a基因外显子和内含子的全基因组扩增，获得该基因的DNA全长，并划分成不同长度的片段进行扩增，获得IGF2a基因不同片段的SNP信息，完成整个基因的基因组扫描。本发明专利技术提供的方法可用于检测与经济性状相关的鲤IGF2a基因SNP位点，也可用起分析该位点与该基因表达量的关系等后续工作。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于鱼类分子设计育种
，尤其涉及一种检测鲤IGF2a基因SNP的方法及引物。
技术介绍
鲤是我国养殖面积广、抗逆性强、产量大的重要淡水经济鱼类。据《中国渔业统计年鉴》，2011年我国大宗淡水鱼产量达1698.50万吨，其中鲤鱼产量为271.82万吨。可以看出，鲤鱼的生产在我国占有举足轻重的地位。类胰岛素生长因子(insulin-like growth factor，IGF)是一种促细胞分裂的多肽，包括IGF1和IGF2，其结构与胰岛素相类似。IGF是生长激素发挥作用的中间信使，即生长激素首先作用于IGF，再由IGF作用于靶器官，进而发挥其促进生长发育的作用。目前IGF2已经在金头鲷、罗非鱼、斑马鱼、河豚、鲤、大麻哈鱼中是确定表达的。值得提出的是，斑马鱼存在IGF2a和IGF2b 2种基因。在对鲤的IGF2基因进行研究发现，Tse等在2002年首先成功克隆了鲤的IGF2基因，其在鲤肝脏、心脏、脑等组织中广泛表达。同样Su等2012年发现在鲤体内同样存在IGF2a、IGF2b 2种基因，而Tse等发现的为IGF2b基因。但目前为止还未见到对该基因进行基因组扫描寻找SNP的报道，仅有本实验室发表的关于该基因小片段SNP检测，无法从根本上、整体上检测该基因SNP位点与与鲤生长性状的相关性。本研究为了克服这些不足，研究透该基因SNP位点与鲤生长形状的相关性，找到了一种可以检测到与鲤生长形状有关的所有该基因的SNP位点的方法。
技术实现思路
解决的技术问题：本专利技术的目的在于寻找与生长性状关联的IGF2a基因潜在SNPs的检测手段，提供一种鲤基因组中获取候选基因全基因组的SNP方法及引物。技术方案：一种引物组，该引物组用于扩增鲤鱼IGF2a基因cDNA序列，该引物组包括以下引物：IGF2a11#正向引物5’-3’：GACAGCCACAAGCATCACT，IGF2a11#反向引物5’-3’：TTTCTCCATCTGCCTCCTA；IGF2a 22#正向引物5’-3’：CTCTTCACAAGGACACCATA，IGF2a 22#反向引物5’-3’：AAGCTTCCATTGACTTTACT；IGF2a 33#正向引物5’-3’：GTGCCTCTTATTGCTTTCTACC，IGF2a 33#反向引物5’-3’：GAAACATCTCGCTCGGACTT。一种引物组，该引物组用于扩增鲤鱼IGF2a基因序列，该引物组包括以下引物：IGF2a1#正向引物5’-3’：CCACAAGCATCACTCAAAGAA，IGF2a1#反向引物5’-3’：CCGTAGTCAACCCGTATCG；IGF2a 2#正向引物5’-3’：AAATCAGCACAGTCACAGCAG，IGF2a 2#反向引物5’-3’：GGGGAAGTTCTCCGTCATC；IGF2a 3#正向引物5’-3’：GTGCCTCTTATTGCTTTCTACC，IGF2a 3#反向引物5’-3’：GAAACATCTCGCTCGGACTT；IGF2a 4#正向引物5’-3’：GCAAAGCCTGTGAAGTCCG，IGF2a 4#反向引物5’-3’：CATATTTCCATGCCAAGAGCA；IGF2a 5#正向引物5’-3’：AAAATCTTGTGCCATGTGCTC，IGF2a 5#反向引物5’-3’：GGCTTTCTTTGCCATACTTCA；IGF2a 6#正向引物5’-3’：CTGATTACGCCAGCTTGGT，IGF2a 6#反向引物5’-3’：GTTTCCGGTTTGAGTTTCTGT；IGF2a 7#正向引物5’-3’：AATGACAGTGAAGACGATTTGC，IGF2a 7#反向引物5’-3’：TCTGTCTTGCTTGCACCCTA；IGF2a 8#正向引物5’-3’：GCAGGTAAAGGACTCTAATCTCG，IGF2a 8#反向引物5’-3’：AAATGGGAACAAACAAGGGA；IGF2a 9#正向引物5’-3’：AGAAAGACGGTGGGCGAGTG，IGF2a 9#反向引物5’-3’：ACAAGGACACCATAGGAGGG。一种检测鲤IGF2a基因单核苷酸多态性的方法，包括以下步骤：(1)对待测鲤鱼样本IGF2a基因cDNA序列通过权利要求1所述的引物组进行扩增，得到扩增片段一；(2)对待测鲤鱼样本IGF2a基因序列通过权利要求2所述的引物组进行扩增，得到扩增片段二；(3)将步骤(1)与步骤(2)得到的扩增片段一与扩增片段二分别进行琼脂糖凝胶电泳，然后回收、纯化、测序，再按照斑马鱼基因组序列排列顺序进行拼接，最后得到扩增后的IGF2a基因全基因组序列，同时与斑马鱼基因组序列比较并记录差异位点的具体位置；(4)对待测鲤鱼样本与另一种鲤鱼样本进行正反交组合，对子代利用权利要求1和权利要求2所述的引物组进行基因扩增并按照斑马鱼基因组序列排列方式进行拼接，得到子代IGF2a基因序列；(5)将子代IGF2a基因序列与亲本原始IGF2a基因进行比对，通过检测进一步确认目标序列的变异位点，并与步骤(3)记录的差异位点进行对照，最终得到单核苷酸多态性位点。所述的检测鲤IGF2a基因单核苷酸多态性的方法，步骤(1)或(2)中扩增反应体系可以为10×buffer 15μL，25mmol/L的Mg2+1μL，各2mmol/L的dNTPs 1μL，10mmol/L的上游引物1uL、10mmol/L的下游引物1μL、模板DNA 1μL，TaqDNA聚合酶1U，其余为dd H2O。所述的检测鲤IGF2a基因单核苷酸多态性的方法，步骤(1)或(2)中扩增反应条件可以为94℃预变性3min；94℃变性20s，温度50～58℃退火20s，72℃延伸30s，33个循环；72℃延伸10min。所述的检测鲤IGF2a基因单核苷酸多态性的方法，步骤(3)中琼脂糖凝胶电泳使用的是8％非变性聚丙烯酰胺凝胶。有益效果用IGF2a基因全基因组SNPs检测方法，可对该基因整个基因组序列进行扫描，设计的引物片段都适合直接测序或是结合酶切展开大样本分析，也可针对某一选定区域进行单核苷酸位点检测。这种分析方法可以找出与体重相关的SNP位点，也可用起分析该位点与该基因表达量的关系等后续工作。此种分析方法应用于鱼类以分子标记辅助选择为基础的新品种选育，也可用于开展候选基因功能研究的科学实验。本研究设计引物进行该基因与鲤生长性状相关的IGF2a单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)检测，为研究该多态位点与生长性状的关系以及为分子辅助选择育种奠定基础。附图说明图1为本专利技术实施例1中黄河鲤和建鲤的正反交组合后IGF2a基因序列比对结果图；图2为本专利技术实施例1中IGF2a4#引物检测到的1816号多态位点与建鲤体重体长比的关系图。具体实施方式实施例1从NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)数据库中查取IGF2a基因cDNA序列(HM641129.1)，设计引物进行外显子扩增(引物组见表1)，然后与斑马鱼基因组序列比对，寻找潜在的外显子和内含子的剪切位置，设计引物进行全基因组扩增(引物组见表2)。表1鲤IGF本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种引物组，该引物组用于扩增鲤鱼IGF2a 基因cDNA序列，其特征在于，该引物组包括以下引物：IGF2a11#正向引物5’‑3’：GACAGCCACAAGCATCACT，IGF2a11#反向引物5’‑3’： TTTCTCCATCTGCCTCCTA；IGF2a 22#正向引物5’‑3’： CTCTTCACAAGGACACCATA，IGF2a 22#反向引物5’‑3’： AAGCTTCCATTGACTTTACT；IGF2a 33#正向引物5’‑3’： GTGCCTCTTATTGCTTTCTACC，IGF2a 33#反向引物5’‑3’： GAAACATCTCGCTCGGACTT。
【技术特征摘要】
1.一种引物组，该引物组用于扩增鲤鱼IGF2a 基因cDNA序列，其特征在于，该引物组包括以下引物：IGF2a11#正向引物5’-3’：GACAGCCACAAGCATCACT，IGF2a11#反向引物5’-3’： TTTCTCCATCTGCCTCCTA；IGF2a 22#正向引物5’-3’： CTCTTCACAAGGACACCATA，IGF2a 22#反向引物5’-3’： AAGCTTCCATTGACTTTACT；IGF2a 33#正向引物5’-3’： GTGCCTCTTATTGCTTTCTACC，IGF2a 33#反向引物5’-3’： GAAACATCTCGCTCGGACTT。2.一种引物组，该引物组用于扩增鲤鱼IGF2a 基因序列，其特征在于，该引物组包括以下引物：IGF2a1#正向引物5’-3’： CCACAAGCATCACTCAAAGAA，IGF2a1#反向引物5’-3’： CCGTAGTCAACCCGTATCG；IGF2a 2#正向引物5’-3’：AAATCAGCACAGTCACAGCAG，IGF2a 2#反向引物5’-3’：GGGGAAGTTCTCCGTCATC；IGF2a 3#正向引物5’-3’： GTGCCTCTTATTGCTTTCTACC，IGF2a 3#反向引物5’-3’： GAAACATCTCGCTCGGACTT；IGF2a 4#正向引物5’-3’：GCAAAGCCTGTGAAGTCCG，IGF2a 4#反向引物5’-3’： CATATTTCCATGCCAAGAGCA；IGF2a 5#正向引物5’-3’：AAAATCTTGTGCCATGTGCTC，IGF2a 5#反向引物5’-3’：GGCTTTCTTTGCCATACTTCA；IGF2a 6#正向引物5’-3’： CTGATTACGCCAGCTTGGT，IGF2a 6#反向引物5’-3’：GTTTCCGGTTTGAGTTTCTGT；IGF2a 7#正向引物5’-3’：AATGACAGTGAAGACGATTTGC，IGF2a 7#反向引物5’-3’： TCTGTCTTGCTTGCACCCTA；IGF2a 8#正向引物5’-3’：GCAGGTAAAGG...
【专利技术属性】
技术研发人员：苏胜彦，董在杰，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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