本发明专利技术提供了一种检测血吸虫病循环抗原的酶联免疫试剂盒，包括包被有包被原的酶标板、酶标记物、包被缓冲液、浓缩洗涤液、样品稀释液、血吸虫病阳性血清、血吸虫病阴性血清、显色液、终止液，包被有包被原的酶标板是包被抗血吸虫可溶性抗原的单克隆抗体IgG2b的酶标板,酶标记物为酶标记的抗血吸虫可溶性抗原的单克隆抗体IgM。本发明专利技术还提供了上述的试剂盒的制备方法，本发明专利技术的酶联免疫试剂盒敏感性高、特异性强、重复性好，分别适合批量标本的检测和疗效考核。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物工程领域，尤其涉及一种试剂盒，特别是一种基于IgG2b、IgM两种单抗的检测血吸虫病循环抗原的酶联免疫试剂盒及制备方法。
技术介绍
1、免疫诊断在日本血吸虫病防治中的重要性血吸虫病是一种广泛流行于热带和亚热带地区的人兽共患寄生虫病，全球76个国家和地区的约2亿人口受感染，有6亿人口受感染威胁。我国是日本血吸虫病流行区，建国初期曾严重影响了人们的正常生产和生活。经过50多年的防治，已经取得了举世瞩目的成就，到2003年全国共有血吸虫病病人数843007人，较建国初期(1161. 2万人)减少了 92.74%。已有广东、上海、福建、广西、浙江等5省(区、市)阻断了血吸虫病的传播；仅剩湖南、湖北、江西、安徽、江苏等5省湖区及川、滇山区未得到控制。我们在欣喜的同时，也面临着进一步防治工作的巨大挑战。随着防治工作的深入，人群感染度不断下降，低度流行区扩大，血吸虫病的病原学诊断在现场大范围的应用越来越困难，不但敏感性差、费时费力， 且不易被群众和工作人员接受。另一方面，现在控制血吸虫病的主要手段是吡喹酮化疗，但大规模、反复单一药物化疗，可能产生药物抗性，据国外报道，已经出现具吡喹酮抗性的曼氏血吸虫株，因此研制用于血吸虫病低度流行区的敏感性和特异性更高的诊断手段已经被列为第三大世界血吸虫病防治规划优先研究项目。2、循环抗原在日本血吸虫病免疫诊断中的作用经过几十年的发展，血吸虫病免疫诊断技术已具有较高的敏感性、特异性和可行性。检测血吸虫循环抗体是一种成本低、操作简单的检测，也是目前现场流行病学调查时应用最广的途径，但循环抗体在治疗后相当长一段时间内仍保持较高水平，不易区分既往感染和现症感染，无法在现场应用时确定目标化疗人群；而且难以反映药物疗效，不宜用作疗效考核的评价指标。另一种途径是检测循环抗原，循环抗原(circulating antigen, CAg) 是存在于患者血液、唾液、尿液等体液中的血吸虫虫体的代谢产物及分泌物，检测患者血清或尿液中的循环抗原，可评估虫负荷数和活动性感染，可以作为诊断的依据。而且，在治疗后，CiVg转阴较快，检测循环抗原可以作为疗效考核的依据，基于循环抗原检测的各种方法层出不穷，但都困扰在敏感性低、特异性不强的问题上，因此寻找敏感性高、特异性强的循环抗原检测方法和技术是血吸虫病免疫诊断的新方向。3.单克隆抗体技术在血吸虫病免疫诊断技术中的应用自Kohler和Milstein(197 专利技术单克隆抗体制备技术以来，单抗技术广泛运用于医学和生物学的各个领域，为疾病的发生、发展、诊断和治疗提供了重要的手段。单克隆抗体是由一个细胞产生的，其成分(类，亚类，型和结合P位等)是同源的，只针对复杂抗原的一个抗原决定簇，并有相同的亲和性，抗体滴度也很高，检测循环抗原具有高度的特异性，抗原和单抗可规模化生产，方法简便实用，且具有较好的疗效考核价值，可区分现症感染与既往感染，可用于血吸虫病的免疫诊断和流行病学现场调查。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供，所述的这种检测血吸虫病循环抗原的酶联免疫试剂盒及制备方法要解决现有技术的检测血吸虫循环抗原的方法敏感性低、特异性不强的技术问题。本专利技术提供了一种检测血吸虫病循环抗原的酶联免疫试剂盒，包括包被有包被原的酶标板、酶标记物、包被缓冲液、浓缩洗涤液、样品稀释液、血吸虫病阳性血清、血吸虫病阴性血清、显色液和终止液，所述的包被有包被原的酶标板是包被抗血吸虫可溶性抗原的单克隆抗体IgG2b的酶标板，所述的酶标记物为酶标记的抗血吸虫可溶性抗原的单克隆抗体 IgM。进一步的，所述的浓缩洗涤液为浓度是0. 01 0. 05mol/L的磷酸盐缓冲液，pH值为7. 0-7. 4，所述的磷酸盐缓冲液还含有吐温20和叠氮化钠，所述的吐温20在所述的磷酸盐缓冲液中的质量百分比为1%，所述的叠氮化钠在所述的磷酸盐缓冲液中的质量百分比为 0. 3%。进一步的，所述的样品稀释液为洗涤缓冲液，洗涤缓冲液为上述浓缩洗涤液的 18-22倍稀释的工作液；优选的为上述浓缩洗涤液的20倍稀释工作液。进一步的，所述的酶标记物为辣根过氧化物酶标记的抗血吸虫可溶性抗原单克隆抗体IgM，所述的显色液由第一显色液和第二显色液组成，第一显色液为过氧化氢溶液，第二显色液为四甲基联苯胺溶液，终止液为2mol/L的硫酸。进一步的，所述的酶标记物为碱性磷酸酶标记的抗血吸虫可溶性抗原单克隆抗体 IgM，所述的显色液为4-硝基酚磷酸盐缓冲液，所述的终止液为lmol/L的氢氧化钠缓冲液。进一步的，所述的血吸虫病阳性血清为血吸虫病人血清或实验感染血吸虫的家兔血清，所述的血吸虫病阴性血清为健康人血清或正常兔血清。进一步的，所述的酶标板为96孔可拆卸聚苯乙烯酶标板。进一步的，所述的包被缓冲液为pH值9. 6的0. 05mol/L的碳酸盐缓冲液。进一步的，所述的包被抗血吸虫可溶性抗原单克隆抗体的酶标板中的日本血吸虫可溶性抗原单克隆抗体IgG2b由保藏号为CGMCC NO :4978的小鼠杂交瘤细胞产生。进一步的，所述的酶标记的抗血吸虫可溶性抗原单克隆抗体中的抗血吸虫可溶性抗原单克隆抗体IgM由保藏号为CGMCC NO 3642的小鼠杂交瘤细胞产生。本专利技术还提供了一种上述的检测血吸虫病循环抗原的酶联免疫试剂盒的制备方法，包括如下步骤1) 一个制备包被有包被原的酶标板的步骤，所述的包被有包被原的酶标板是包被抗血吸虫可溶性抗原单克隆抗体的酶标板；2)包括一个制备酶标记物的步骤，所述的酶标记物为酶标记的抗血吸虫可溶性抗原单克隆抗体，采用辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记；3)包括一个制备包被缓冲液的步骤；4)包括一个制备浓缩洗涤液的步骤；5)包括一个制备样品稀释液的步骤；6)包括一个制备血吸虫病阳性血清和血吸虫病阴性血清的步骤；7)包括一个制备显色液和一个制备终止液的步骤；8)包括一个将上述产品组装的步骤。进一步的，所述的包被有包被原的酶标板和酶标记物中的抗血吸虫可溶性抗原单克隆抗体均采用杂交瘤技术制备的，包括如下步骤，1) 一个动物免疫的步骤，在所述的动物免疫的步骤中，先制备日本血吸虫的可溶性抗原，然后通过日本血吸虫的可溶性抗原免疫动物；2) —个细胞融合的步骤，取骨髓瘤细胞SP2/0与免疫脾细胞按1 5 1 10比例在PEG4000作用下进行融合；3) 一个杂交瘤细胞筛选和克隆化的步骤；4)将单克隆细胞株注入动物体内产生抗体的步骤；5) 一个纯化抗血吸虫可溶性抗原的单克隆抗体的步骤。进一步的，在一个制备包被有包被原的酶标板的步骤中，用包被缓冲液将抗血吸虫可溶性抗原的单克隆抗体IgG2b，然后将抗血吸虫可溶性抗原的单克隆抗体IgG2b加入酶标板的孔中孵育，倒去包被液，用浓缩洗涤液洗后，拍干后真空密封保存。进一步的，在一个制备浓缩洗涤液的步骤中，所述的浓缩洗涤液为浓度是0.01 0. 05mol/L磷酸盐缓冲液，pH值为7. 0-7. 4，所述的磷酸盐缓冲液还含有吐温20和叠氮化钠，所述的吐温20在所述的磷酸盐缓冲液中的质量百分比为1%，所述的叠氮化钠在所述的磷酸盐缓冲液中的质量百分比为0. 3%。进一步的，在一个制备样品稀释液的步骤中，所述的样品稀释液为洗涤缓冲液，洗涤缓冲液为上述浓缩洗涤液的18-22倍稀释的工作液本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种检测血吸虫病循环抗原的酶联免疫试剂盒，其特征在于：包括包被有包被原的酶标板、酶标记物、包被缓冲液、浓缩洗涤液、样品稀释液、血吸虫病阳性血清、血吸虫病阴性血清、显色液和终止液，所述的包被有包被原的酶标板是包被抗血吸虫可溶性抗原的单克隆抗体ＩｇＧ２ｂ的酶标板，所述的酶标记物为酶标记的抗血吸虫可溶性抗原的单克隆抗体ＩｇＭ。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈家旭，蔡玉春，郭俭，陈韶红，田利光，陈木新，张玲玲，艾琳，周洋，
申请(专利权)人：中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所，
类型：发明
国别省市：31
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