【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种狂犬病毒固定株的选育方法及其应用，具体涉及一种高免疫原性狂犬病毒固定株的选育及其在狂犬病疫苗开发中的应用。
技术介绍
狂犬病是一种严重的致死性流行病。感染狂犬病毒后一旦出现临床症状，存活的预后极差，死亡几乎不可避免。目前全球超过25亿人生活在狂犬病流行区而受到该疾病的威胁，每年导致5万多人死亡，其中半数以上是年龄小于15岁的儿童，他们是感染狂犬病的高危人群。中国也是狂犬病流行高发区，狂犬病死亡率长期居于中国各类法定传染病首位。由于没有任何针对狂犬病的有效治疗药物能够成功得到应用，研发狂犬病疫苗(包括人用疫苗和动物用疫苗)成为控制疾病危害的唯一有效手段。人用狂犬病疫苗的研发历史已超过百年。鉴于狂犬病的超高致死率，疫苗品种更新换代的需求比其他流行病疫苗更为迫切，研发更为安全有效的新一代人用狂犬病疫苗成为疫苗开发的热点。国内外研发了种类繁多的人用狂犬病疫苗新品种，包括全病毒灭活疫苗、减毒活疫苗、基因工程疫苗、DNA疫苗等。在这些不同类型人用狂犬病疫苗研发品种中，全病毒灭活疫苗的保护效果是最好的，也是目前唯一得到临床应用的人用狂犬病疫苗。预计在未来相当...
【技术保护点】
高免疫原性狂犬病毒固定株的选育，其特征在于：包括如下步骤：（1）鼠脑毒种的扩增和纯化从国内外被普遍认可的病毒保藏机构取回aG株或经动物脑组织传代建株的狂犬病毒固定株，病毒接种于20?25日龄豚鼠脑腔，豚鼠出现典型狂犬病症状时，无菌条件下取脑，加入维持液A：含0.5%牛白蛋白的M199培养基，PH7.0—8.0后，研磨脑组织制成匀浆，高速离心除去沉淀，上清液经蔗糖密度梯度超速离心3?5小时，收取蔗糖浓度为45%?55%的组份，透析去除蔗糖，稀释制成滴度为9.0?10.0LogLD50/ml病毒悬液；（2）鼠脑病毒对Vero细胞：非洲绿猴肾细胞的适应培养贴壁培养24?72小时的...
【技术特征摘要】
1.高免疫原性狂犬病毒固定株的选育，其特征在于:包括如下步骤: (1)鼠脑毒种的扩增和纯化 从国内外被普遍认可的病毒保藏机构取回aG株或经动物脑组织传代建株的狂犬病毒固定株，病毒接种于20-25日龄豚鼠脑腔，豚鼠出现典型狂犬病症状时，无菌条件下取脑，加入维持液A:含0.5%牛白蛋白的M199培养基，PH7.0—8.0后，研磨脑组织制成匀浆，高速离心除去沉淀，上清液经蔗糖密度梯度超速离心3-5小时，收取蔗糖浓度为45%-55%的组份，透析去除蔗糖，稀释制成滴度为9.0-10.0LogLD50/ml病毒悬液； (2)鼠脑病毒对VeiO细胞:非洲绿猴肾细胞的适应培养 贴壁培养24-72小时的Vero细胞，用胰蛋白酶消化并离心收集细胞；加入含胰蛋白酶/EDTA/牛血清白蛋白的M199培养基，PH7.0-8.0，制成密度为5X 105_2X 106cells/ml的细胞悬液；按病毒:细胞为1:1——I: 100的量加入步骤(I)制备的病毒悬液，25-40°C条件下放置10-60分钟；加入含5-10%牛血清的M199培养基，PH7.0-8.0，接种细胞培养瓶，接种量0.5X IO5-1X 105cells/cm2，37°C条件下贴壁培养；24_48小时后培养液更换成含0.5%牛血清白蛋白的M199培养基，PH7.0-8.0，30_34°C条件下贴壁培养；96_144小时后收获培养液，蔗糖密度梯度超速离心纯化和浓缩病毒，制备病毒悬液，为低代次细胞适应病毒； (3)Vero细胞培养病毒在裸鼠脑组织中扩增 步骤(2)得到的病毒悬液接种裸鼠脑腔，裸鼠出现典型狂犬病症状时，无菌条件下取脑，按步骤一同样方法制备病毒悬液； 病毒在裸鼠脑组织和Vero细胞上交替传代 重复步骤(2)和步骤(3)，病毒在裸鼠脑组织和VeiO细胞上交替传代2-10次，制备Vero细胞传代培养的病毒悬液；` (5)可使Vero细胞适应的病毒突变体包括高免疫原性的突变体不断得到优选的方法: 病毒在VeiO细胞上连续传代 步骤(4)得到的病毒悬液接种贴壁培养的Vero细胞，32-34°C培养72-168小时，收获病毒培养液，小鼠脑腔法测定病毒滴度，并在Vero细胞上连续传代，直到病毒滴度高于`7.5LogLD50/ml ； (6)可使VeiO细胞适应的病毒突变体包括高免疫原性的突变体进一步得到优选 病毒单克隆纯化、筛选和保存建株 步骤(5)得到的滴度高于7.5Lo...
【专利技术属性】
技术研发人员：艾文，沈名锋，刘钿莲，
申请(专利权)人：广州银河阳光生物制品有限公司，
类型：发明
国别省市：
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