本发明专利技术公开了一种检测鸭瘟病毒IgG抗体的间接ELISA方法。所述方法的鸭瘟标准阳性血清1mL和标准阴性血清1mL；包被病毒为鸭瘟病毒贵州株，并进行纯化所得，使用包被缓冲液稀释为2.0μg/100μL；包被缓冲液：Na2CO31.59g、NaHCO32.93g溶于去离子水中，定容至1000mL，调至pH9.6；酶标二抗：羊抗鸭IgG-HRP，按1:50倍稀释待用；1×PBST缓冲液：NaCl8.0g、KCl0.2g、KH2PO40.2g、Na2HPO4·12H2O2.9g、Tween-200.5mL溶于800mL蒸馏水，调整pH为7.4，定容至1000mL；封闭缓冲液：BSA1.0g溶于100mlPBST缓冲液；底物液A：Na2HPO414.60g、柠檬酸9.33g、过氧化氢脲0.52g，溶于三蒸水，并定容至1000mL，调至pH5.2；底物液B：TMB20mg、无水乙醇10mL，加双蒸水至1000mL，过滤除菌，无菌分装；终止液：1.25mol/LH2SO4溶液。本发明专利技术能有效检测鸭瘟抗体效价，从而为养鸭业的综合防控提供重要监测手段。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种检测鸭瘟病毒IgG抗体的间接ELISA方法。所述方法的鸭瘟标准阳性血清1mL和标准阴性血清1mL；包被病毒为鸭瘟病毒贵州株，并进行纯化所得，使用包被缓冲液稀释为2.0μg/100μL；包被缓冲液：Na2CO31.59g、NaHCO32.93g溶于去离子水中，定容至1000mL，调至pH9.6；酶标二抗：羊抗鸭IgG-HRP，按1:50倍稀释待用；1×PBST缓冲液：NaCl8.0g、KCl0.2g、KH2PO40.2g、Na2HPO4·12H2O2.9g、Tween-200.5mL溶于800mL蒸馏水，调整pH为7.4，定容至1000mL；封闭缓冲液：BSA1.0g溶于100mlPBST缓冲液；底物液A：Na2HPO414.60g、柠檬酸9.33g、过氧化氢脲0.52g，溶于三蒸水，并定容至1000mL，调至pH5.2；底物液B：TMB20mg、无水乙醇10mL，加双蒸水至1000mL，过滤除菌，无菌分装；终止液：1.25mol/LH2SO4溶液。本专利技术能有效检测鸭瘟抗体效价，从而为养鸭业的综合防控提供重要监测手段。【专利说明】—种检测鸭瘟病毒IgG抗体的间接ELISA试剂盒及制备方法
本专利技术涉及。
技术介绍
鸭痕(DuckPlague, DP)又称鸭病毒性肠炎(Duck Virus Enteritis, DVE),是由鸭肠炎病毒(Duck Enteritis Virus, DEV)引起的鸭、鹅等雁形目禽类的一种急性、败血性和高度接触性的传染病，是目前对世界范围水禽养殖业危害最为严重的疫病之一，自1957年黄引贤在广东省首次证实鸭瘟病毒在我国流行以来，全国其他省份包括贵州等地陆续发现，给贵州省养鸭业的发展带来了极大的危害。鸭瘟是可以通过疫苗免疫得到良好控制的一种疾病，但由于某些不可预知的原因，导致免疫失败现象时有发生。血清学检测是制定和实施鸭瘟防制措施的一个关键环节，目前常用的血清学检测方法有病毒中和试验、琼脂免疫扩散试验、酶联免疫吸附试验等，其中，ELISA方法因其具有方便、快捷等优点具有重要潜在开发前景。目前，对鸭瘟的控制主要通过疫苗接种来完成，但随着贵州省畜牧业的发展，特别是贵州省将三穗鸭作为地方特色优势产业开发以来，三穗鸭的年养殖量持续上升，预计到2025年贵州三穗鸭产业区每年鸭的生产总量达4亿羽以上，这对该病的预防带来较大的威胁。目前，我国尚未建立商品化的鸭瘟血清抗体检测试剂盒，使该病的临床控制缺乏了一种关键实时的监测手段，因此，建立一种可行的鸭瘟血清抗体检测方法是十分必要的。本专利技术通过鸭胚增殖鸭瘟病毒，建立了一种快速检测鸭瘟病毒IgG抗体的间接ELISA试剂盒，将为养鸭业的综合防控提供重要监测手段。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是:提供一种快速检测鸭瘟病毒IgG抗体的间接ELISA试剂盒，并进行条件优化，制备成商品化的间接ELISA试剂盒。该间接ELISA试剂盒的专利技术，将为养鸭业的鸭瘟免疫效果评价提供一种有效手段。本专利技术的技术方案是:一种用于检测鸭瘟病毒贵州株抗体的间接ELISA试剂盒，其组成包括:包被病毒50 μ L~200 μ L、包被缓冲液25mL~40mL、酶标二抗300~500 μ L、IXPBST缓冲液80(Tl000mL、阳性对照lmL、阴性对照lmL、封闭缓冲液25mL~40mL、底物液AlOmL~15mL、底物液BlOmL~15mL和终止液IOmL~15mL。所述的包被缓冲液浓度为2.0 μ g/100 μ L^6.5 μ g /100 μ L。所述酶标二抗作1:100^300倍体积稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鸭IgG。所述的阳性对照使用时用血清稀释液按l:l(Tl:200倍稀释；所述的阴性对照为未感染且未免疫鸭瘟疫苗的鸭血清，稀释度为1: l(Tl: 200。所述的封闭缓冲液为:BSA 1.0g溶于IOOmL PBST缓冲液；所述底物液A为:Na2HPO4 14.60g、柠檬酸9.33g和过氧化氢脲0.52g,溶于三蒸水，并定容至1000mL,调至pH5.0^5.4 ;所述底物液B为:TMB 20mg和无水乙醇IOmL,加双蒸水至1000mL,过滤除菌。所述的终止液为1.25mol/L H2SO4溶液。用于检测鸭瘟病毒贵州株抗体的间接ELISA试剂盒的制备方法，它包括以下步骤: 第一，将贵州株鸭瘟通过鸭胚增殖，获得含有鸭瘟病毒贵州株的粗蛋白，通过层析柱进行病毒蛋白纯化； 第二，步骤一的纯化病毒作为包被抗原，进行抗原包被液浓度、抗原包被条件、封闭液、血清稀释度、封闭时间、酶标二抗稀释浓度和显色反应时间按间接ELISA的条件优化； 第三，取20份已经DEV抗体阴性的鸭血清，按步骤二确定的最佳反应条件，进行间接ELISA反应；样本0D630nm值≥阴性样本0D630nm值的平均值(X) +3 (标准差)，可在99%的水平上判断为阳性，当样本(?63011111值<阴性样本0D630nm值的平均值(X)+3(标准差)时，判为阴性。本专利技术的有益效果:本专利技术适用于检测鸭瘟抗体，能够体现机体内抗体水平，为养鸭场鸭瘟病毒免疫提供一种有效评价手段， 减少生产中疫苗免疫的盲目性，降低生产成本。【专利附图】【附图说明】图1为本专利技术的基于鸭瘟病毒贵州株的间接ELISA试剂盒制备生产流程图。【具体实施方式】本专利技术的实施例: 基于鸭瘟病毒贵州株的间接ELISA试剂盒原料及配方为: 鸭瘟标准阳性血清ImL和标准阴性血清ImL ;包被病毒为鸭瘟病毒贵州株，并进行纯化所得，使用包被缓冲液稀释为2.0 μ g/100 μ L ;包被缓冲液=Na2CO3 1.59g、NaHCO3 2.93g溶于去离子水中，定容至1000mL,调至pH9.6 ;酶标二抗:羊抗鸭IgG-HRP，按1:50倍稀释待用；1XPBST 缓冲液:NaCl 8.0g,KCl 0.2g,KH2PO4 0.2g、Na2HPO4.12H20 2.9g、Tween-200.5mL溶于800mL蒸馏水，调整pH为7.4，定容至1000mL ;封闭缓冲液:BSA1.0g溶于100mlPBST缓冲液；底物液A =Na2HPO4 14.60g、柠檬酸9.33g、过氧化氢脲0.52g，溶于三蒸水，并定容至1000mL,调至pH5.2 ;底物液B:TMB 20mg、无水乙醇IOmL,加双蒸水至1000mL,过滤除菌，无菌分装；终止液:1.25mol/L H2SO4溶液。所述的基于鸭瘟病毒贵州株的间接ELISA试剂盒制备步骤包括: 第一，纯化鸭瘟病毒的获得。通过鸭胚增殖获得含有鸭瘟病毒贵州株的粗蛋白，通过层析柱进行病毒蛋白纯化，经紫外分光光度计进行纯化效果检测及定量； 第二，步骤一的纯化病毒作为包被抗原，采用矩阵法对间接ELISA反应条件进行优化。ELISA方法最佳反应条件:抗原包被液浓度2.0 μ g/100 μ L ;血清稀释度1:10 ;抗原包被条件室温12h ;封闭液1%BSA，封闭时间Ih ;酶标二抗稀释浓度1:200 ;显色反应时间IOmin ；第三，取20份已经鸭瘟抗体阴性的鸭血清，按步骤二确定的最佳反应条件进行间接ELISA反应。样本0D630nm值≥阴性样本0本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于检测鸭瘟病毒贵州株抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于：其组成包括：包被病毒50μL~200μL、包被缓冲液25mL~40mL、酶标二抗300~500μL、1×PBST缓冲液800~1000mL、阳性对照1mL、阴性对照1mL、封闭缓冲液25mL~40mL、底物液A10mL~15mL、底物液B10mL~15mL和终止液10mL~15mL。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：嵇辛勤，阮涌，文明，傅心亮，李世静，
申请(专利权)人：贵州大学，
类型：发明
国别省市：贵州;52
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