本发明专利技术涉及一种登革病毒抗体酶联免疫诊断试剂盒。本发明专利技术所述的试剂盒包括酶标记板、阴性对照血清、阳性对照血清、酶标记物、样品稀释液、浓缩洗涤液、底物显色液、终止液、封板胶，所述酶标记物包含羊抗人ＩｇＧ－ＨＲＰ；所述酶标记板上的包被抗原包括：氨基酸序列为ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１的重组１型登革病毒包膜蛋白特异性抗原；氨基酸序列为ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３的重组２型登革病毒包膜蛋白特异性抗原；氨基酸序列为ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５的重组３型登革病毒包膜蛋白特异性抗原；氨基酸序列为ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７的重组４型登革病毒包膜蛋白特异性抗原。通过检测血清中登革病毒ＩｇＧ抗体，可对二次或以上多次感染登革热的病人进行早期诊断和对健康人群的血清流行病学调查。并可对初次感染登革热的病人进行最后确诊。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，涉及一种酶联免疫诊断试剂盒，尤其是涉及一种登革病毒 抗体酶联免疫诊断试剂盒。
技术介绍
登革热(Dengue Fever, DF )是由4个血清型登革病毒(Dengue Virus, DV )引起的急性蚊媒传染病，主要通过埃及伊蚊或白紋伊蚊叮咬传播。登革病毒属于黄病毒科 (Flaviviridae),黄病毒属(Flavivirus )。 DF是分布最广，发病最多，危害较大的一种虫媒 病毒性疾病，广泛流行于全球热带和亚热带的非洲、美洲、东南亚和西太平洋区的100多 个国家和地区。据WH6估计全球约有25亿人口的健康受到威胁，每年有5000万人感染 登革病毒。随着全球气候变暖日趋严重，登革热地理分布上有蔓延的趋势，发病率和疫情 的严重程度也有所增加，登革热已成为全球性的严重公共卫生问题。登革热在我国经过了 30多年静止期后，1978年广东佛山突然发生流行，自此，登革 热一直是广东省重点防治的传染病。登革热疫情来势急，扩散快，不容易控制，对人民的 生命健康产生巨大威胁、对地方经济发展产生极大影响，因而成为一项重大的公共卫生问 题。登革热疑似病例的尽快确诊可帮助及早发现疫情，尽快采取措施，在最小范围控制疫 情，因而把损失减到最少。目前我国对登革热的实验室诊断主要依靠进口的酶联免疫试剂， 其价格昂贵，在基层医院及市、县级疾控中心难于普及，另外，进口试剂采购到货时间长， 实验室有时未能及时拿到试剂，而延误诊断。首发病人往往由于误诊，没有及时采取有效 措施，而导致登革热疫情蔓延。每宗疫情在其发现时已陷入十分紧张和被动的局面，进而 花费巨大的人力物力去控制。因此，开发出简便、快速、经济、适宜于基层单位推广使用 的登革热诊断试剂成为登革热疫情控制中急需解决的难题。人感染了登革病毒后， 一般经过3-10天(通常4~5天)的潜伏期后，受感染者会 出现以发热、疼痛为主要症状的登革热，同时，机体的免疫系统会产生一系列的免疫应答 反应，初次感染登革病毒，机体产生抗体的速度较慢，滴度也较低，IgM为最初应答的抗体。IgG在发病的第一周末才出现，滴度很低，上升速度也慢。才艮据泛美卫生组织标准， 到发病的第五天，80%可查到检测水平的IgM,发病的第6-10天，93-99%可查到检测水平 的IgM， IgM可持续存在90天以上。二次感染登革病毒的病人，由于IgM抗体远低于初 次感染产生的抗体水平，约有20~30%的病人在二次感染登革病毒后的第10天未能检测 到IgM抗体；而IgG抗体发病后1 ~2天可迅速上升到远远高于初次感染产生抗体的水平， 故可以通过检测登革病毒IgG抗体对二次感染登革的病人进行诊断，并根据抗体滴度高低 对近期感染或继往感染进行判断，IgG抗体可以终生维持。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种登革病毒IgG抗体酶联免疫诊断试剂盒，通过检测血清中 登革病毒IgG抗体，可对二次或以上多次感染登革热的病人进行早期诊断和对健康人群的 血清流行病学调查，并可对初次感染登革热的病人进行最后确诊(双份血清特异性IgG抗 体出现4倍或超过4倍的增长)。本专利技术所述的'一种登革病毒IgG抗体酶联免疫诊断试剂盒，包括酶标记板、阴性对:瞎 血清、阳性对照血清、酶标记物、样品稀释液、浓缩洗涤液、底物显色液、终止液、封板 胶，所述酶标记物包含羊抗人IgG-HRP,即羊抗人IgG-辣根过氧化物酶；所述酶标记板 上的包被抗原为基因工程重组表达的登革病毒包膜蛋白特异性抗原，所述抗原包括氨基 酸序列为SEQ ID No.l的重组1型登革病毒包膜蛋白特异性抗原；氨基酸序列为SEQ ID No.3的重组2型登革病毒包膜蛋白特异性抗原；氨基S交序列为SEQ IDNo.5的重组3型登 革病毒包膜蛋白特异性抗原；氨基酸序列为SEQ IDNo.7的重组4型登革病毒包膜蛋白特 异性抗原。所述重组1型登革病毒包膜蛋白特异性抗原是由SEQ IDNo.2的DNA序列所编码的； 所述重组2型登革病毒包膜蛋白特异性抗原是由SEQ ID No.4的DNA序列所编码的；所 述重组3型登革病毒包膜蛋白特异性抗原是由SEQ ID No.6的DNA序列所编码的；所述 重组4型登革病毒包膜蛋白特异性抗原是由SEQ IDNo.8的DNA序列所编码的。所述的阳性对照血清是在含20%山羊血清和0.02%叠氮钠的10mM的pH7.4的PBS中， 加入确定浓度的阳性血清制成，阳性对照的A值应大于1.5;阴性对照血清是在含20%山 羊血清和0.02。/。叠氮钠的10mM的pH7.4 PBS中，按5%的比例加入混合好的阴性血清 制成，阴性对照的A值应小于0.1。所述酶标记板的制备方法是将所述的基因工程重组表达的登革病毒包膜蛋白特异性 抗原按确定的浓度用0.05M的pH9.6的CP即碳酸盐緩冲液稀释后，按O.lml/孔包被到微 孔板内，在2°C ~ 8。C吸附24 ~ 26小时后，用10mM PBST即吐温磷酸緩沖液按0.25ml/孔 洗板，再用封闭液按0.15ml/孔在2。C 8。C封闭18-20小时，弃除多余的封闭液，经真空 干燥处理后用铝膜袋密封，置2 8。C保存。所述的封闭液的组成为含20%山羊血清和0.02%叠氮钠的pH7.4的10mM磷酸緩沖 液即PBS。所述的酶标记物是用酶标稀释液按工作浓度配制的羊抗人IgG -HRP工作液，所述的 酶标稀释液的组成为pH7.4的10mMPBS即磷酸緩冲液，其中含10%山羊血清、0.2%吐 温-20和0.02%叠氮钠。登革病毒为单股正链RNA病毒，长度约为11 Kb,编码3400个氨基酸，分子量为4200 KDa。基因组含有一个长的开放读码框架，编码病毒的全部蛋白包括3种结构蛋白和7 个非结构(NS)蛋白。其中E结构蛋白是一种包膜糖蛋白，亚群特异和型特异的抗原决定 簇及中和、血'凝抑制作用的主要抗原表位均位于包膜蛋白E上，因此E结构蛋白对'病原诊 断具有重要意义。本专利技术所述的登革病毒IgG抗体酶联免疫诊断试剂盒采用重组登革病毒1-4型E蛋白 B区的型特异性抗原(约120个氨基酸)，避免与黄热病毒、乙型脑炎病毒抗原产生交叉反 应。国外商品化登革病毒抗体酶联免疫诊断试剂多采用纯化的全病毒抗原，这些试剂缺点 是本底高，与黄病毒科病毒存在交叉反应，最常见者为乙型脑炎病毒与黄热病毒。本专利技术 研制的试剂盒克服了国外试剂的缺点。与国内外同类产品比较在国内尚无检测登革病毒抗体的酶免试剂。在国外，常用的登革热酶联免疫诊断试剂 全部采用细胞培养后纯化的全病毒抗原。如目前唯一获得美国FDA批准文号的澳大利亚 PanBio公司生产的Dengue IgG ELISA诊断试剂盒，其不足在于本底高，因而需要借助酶 标比色仪检测，阈值(cut-off值)为0.4-0.65,与黄病毒科病毒如乙型脑炎病毒存在交叉反 应。本专利技术制备的登革病毒IgG抗体酶联免疫诊断试剂是间接法IgG - ELISA，方法简便、 易操作，灵敏性高，与黄热病毒、乙型脑炎病毒抗原不产生交叉反应。本专利技术的研究成果填补了我国登￥热诊断试剂的空白，为我国登革热的临床诊断、血 清学监测和流行病学调查提供了新的技术手段，具有广泛的推广应用前景。附图说明图1为表达质粒的构建示意图。图2为本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种登革病毒ＩｇＧ抗体酶联免疫诊断试剂盒，包括酶标记板、阴性对照血清、阳性对照血清、酶标记物、样品稀释液、浓缩洗涤液、底物显色液、终止液、封板胶，其特征在于： 所述酶标记物包含羊抗人ＩｇＧ－ＨＲＰ，即羊抗人ＩｇＧ－辣根过氧化物酶； 所述酶标记板上的包被抗原为基因工程重组表达的登革病毒包膜蛋白特异性抗原，所述抗原包括： 氨基酸序列为ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１的重组１型登革病毒包膜蛋白特异性抗原； 氨基酸序列为ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３的重组２型登革病毒包膜蛋白特异性抗原； 氨基酸序列为ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５的重组３型登革病毒包膜蛋白特异性抗原； 氨基酸序列为ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７的重组４型登革病毒包膜蛋白特异性抗原。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：江立敏，周惠琼，郑夔，柯昌文，
申请(专利权)人：广东省疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]
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