一种抗狂犬病毒的基因工程抗体、其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，公开了一种抗狂犬病毒的基因重组抗体、其制备方法和应用。本发明专利技术提供的基因工程抗体由重组抗狂犬病毒抗体的重链可变区、重组抗狂犬病毒抗体的轻链可变区组装而成；该重组抗狂犬病毒抗体的重链可变区融合有亮氨酸拉链；该重组抗狂犬病毒抗体的轻链可变区融合有亮氨酸拉链。本发明专利技术提供的基因工程抗体具有较高的狂犬病毒中和能力；且结构简单，易于构建，可实现在原核系统中的高效表达，因而更易于实现其工业化大生产。

【技术实现步骤摘要】
一种抗狂犬病毒的基因工程抗体、其制备方法和应用
本专利技术属于基因工程
，特别涉及一种抗狂犬病毒的基因工程抗体、其制备方法和应用。
技术介绍
狂犬病是由动物传播的100％致死性传染病，该病流行于100多个国家和地区，在全球范围内，每年有高达55000人因狂犬病死亡，而我国的狂犬病病例在2000份左右。当被携带有狂犬病毒的动物严重咬伤或抓伤时，即狂犬病毒III级暴露时，世界卫生组织建议用暴露后预防(PEP)的方法防治狂犬病。暴露后预防的方法包括伤口清洗，疫苗注射和伤口处抗体浸润注射。随着基因工程技术的发展，注射抗狂犬病毒的抗体逐渐成为中和狂犬病毒的重要方法。现在在市面上用于侵润注射的抗体为抗狂犬病毒马血清(Equinerabiesimmuneglobulin，ERIG)和抗狂犬病毒人血清(Humanrabiesimmuneglobulin，HRIG)，二者均能有效的中和狂犬病毒。据报道，用抗狂犬病毒人血清(HRIG)治疗，病人要承担约1000美元的费用，价格过于昂贵，在狂犬病流行的亚非拉地区，人们承担不起，并且抗狂犬病人血清的来源十分有限，大大限制了其应用。相比HRIG，抗狂犬病毒马血清(ERIG)的价格虽有降低，但是其供应量仍不足，并且由马血清导致的过敏反应和血液污染，也限制了其进一步应用。理论上，单克隆抗体(mAb)更适合工业化生产，有望能克服狂犬病免疫血清的不足。但是针对狂犬病毒的单克隆抗体或者说具有中和狂犬病毒活性的单克隆抗体的研究报道相对较少。这是因为在研究过程中发现，一方面狂犬病毒糖蛋白很难在体外表达纯化，即抗原难以获得；另一方面表达狂犬病毒的真核细胞系常常不能稳定传代，且该技术成本过于昂贵，不适合大规模工业生产。基因工程抗体又称重组抗体，是指利用重组DNA及蛋白工程技术对编码抗体的基因按照不同需要进行加工改造和重新装置，经转染适当的受体细胞所表达的抗体分子，是对抗体获得的重要革新。据报道，一系列的抗狂犬病毒基因工程抗体正在研制当中，如植物表达的单克隆抗体(monoclonalantibody，mAb)，Duan等人研发的单链抗体(singledomainfragmentvariable，scFv)等。但目前还没有基因工程抗体上市，所以仍然需要对重组工程抗体进行研究，以获得中和活性高的抗狂犬病毒的重组工程抗体。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的专利技术目的在于提供一种抗狂犬病毒的基因工程抗体、其制备方法和应用。本专利技术提供的抗狂犬病毒的基因工程抗体能够更有效地中和狂犬病毒的能力，能够应用于制备防治狂犬病毒的药物，也可以应用于制备检测狂犬病毒的试剂。为了实现本专利技术的专利技术目的，本专利技术采用如下的技术方案：本专利技术提供了一种抗狂犬病毒的基因工程抗体，其由重组抗狂犬病毒抗体的重链可变区、重组抗狂犬病毒抗体的轻链可变区组装而成；该重组抗狂犬病毒抗体的重链可变区融合有亮氨酸拉链；该重组抗狂犬病毒抗体的轻链可变区融合有亮氨酸拉链。本专利技术的专利技术人致力于研究抗狂犬病毒的基因工程抗体，报道了多个具有中和活性的抗狂犬病毒的基因工程抗体，例如，公开号为CN102643343A的专利申请文件中所述的单链抗体Fv57。单链抗体(scFv)仅由重链可变区(VH)，轻链可变区(VL)和连接肽组成，因此scFv不仅保留了抗体的可变区(Fv)即狂犬病毒G蛋白的结合位点，而且分子量仅为其母体的IgG抗体的1/6，因此可以用原核系统表达，从而大大降低了成本。在研究过程中，专利技术人发现单链抗体Fv57仍无法克服单链抗体的先天性缺陷，即稳定性过低，从而导致其无法像其母体免疫球蛋白G(IgG)抗体那样100％保护被狂犬病毒感染的小鼠。为克服scFv稳定性低这一弱点，在公开号为CN102643343A的专利申请文件中还公开了二硫键稳定单链抗体ds-scFv，即dsFv57，通过将框架区(FR)内特定位置的氨基酸突变为半胱氨酸，在单链抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)之间添加额外的二硫键，从而大大增加了dsFv57的稳定性，相对单链抗体动物保护力得以提高，但是dsFv57的动物保护力仍无法达到100％，这是因为，重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的组装方式在ds-scFv和单链抗体scFv中一致，而和其母体IgG中是不同的。在IgG抗体中重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的作用是非共价的，VH和VL通过自身的疏水作用形成Fv，并由轻链恒定区(CL)和重链恒定区Ⅰ(CHⅠ)之间定疏水作用和二硫键得以稳定；而在单链抗体Fv57和单链抗体dsFv57中，重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的作用是共价的，通过连接肽将重链可变区VH的氨基端和轻链可变区VL的羧基端共价连接而成或VL的氨基端和VH的羧基端共价连接而成，这种共价的连接方式在一定程度上阻碍了重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)组装成正确构象的Fv，因而无法像母体IgG抗体一样动物保护力达到100％。另一方面，在母体IgG抗体中重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)并不存在二硫键，因此突变而来的半胱氨酸改变了可变区的氨基酸序列，鉴于蛋白质的一级结构决定了它的性质，因此这也是单链抗体dsFv57的动物保护力仍无法达到100％原因之一。经过专利技术人大量的创造性劳动，发现抗狂犬病毒的单链抗体在重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)共价连接之后，在一定程度上阻止了Fv正确构象的形成，因此，模拟重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)在IgG抗体中的非共价结合方式是解决现有的抗狂犬病毒的单链抗体中和活性低的方法之一。在本专利技术中，专利技术人试图创新性将亮氨酸拉链应用于抗狂犬病毒的基因工程的构建，具体为单链抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的二聚化。具体地说，以单链抗体Fv57为例，用连接肽将亮氨酸拉链FOS连接到重链可变区(VH)后形成57VH-FOS，将亮氨酸拉链JUN连接到轻链可变区(VL)后形成57VL-JUN，通过亮氨酸拉链FOS和亮氨酸拉链JUN的高效且特异性结合的性质，那么重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)也将高效的、特异性的、非共价的二聚化形成Fv，这种二聚化的Fv与IgG里在CH1和CL的帮助下重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)非共价作用形成Fv是一样的，因此会有更高的中和活性。实验结果证实，相比原单链抗体，本专利技术提供的抗狂犬病毒的基因工程抗体产生了更高的中和活性，差异显著(P＜0.05)。在本专利技术中，亮氨酸拉链为出现在DNA结合蛋白质和其它蛋白质中的一种结构基元(motif)，当来自同一个或不同多肽链的两个两用性的α-螺旋的疏水面(常常含有亮氨酸残基)相互作用形成一个圈对圈的二聚体结构时就形成了亮氨酸拉链。在本专利技术中，本专利技术提供的基因工程抗体中，重组抗狂犬病毒抗体的重链可变区中，亮氨酸拉链可以连接在抗狂犬病毒抗体的重链可变区的碳端或氮端。在本专利技术中，本专利技术提供的基因工程抗体中，重组抗狂犬病毒抗体的轻链可变区中，亮氨酸拉链可以连接在抗狂犬病毒病毒的轻链可变区的碳端或氮端。本领域技术人员可以根据实际情况选择亮氨酸拉链连接在重链可变区或轻链可变区的碳端或氮端。优选地，在本专利技术提供的基因工程抗体中，融合在重组抗狂犬病毒抗体的重链可变区的亮氨酸拉链为JUN亮氨酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗狂犬病毒的基因工程抗体，其特征在于，其由重组抗狂犬病毒抗体的重链可变区、重组抗狂犬病毒的轻链可变区组装而成；所述重组抗狂犬病毒抗体的重链可变区融合有亮氨酸拉链；所述重组抗狂犬病毒抗体的轻链可变区融合有亮氨酸拉链。

【技术特征摘要】
1.一种抗狂犬病毒的基因工程抗体，其特征在于，其由重组抗狂犬病毒抗体的重链可变区、重组抗狂犬病毒的轻链可变区组装而成；所述重组抗狂犬病毒抗体的重链可变区融合有亮氨酸拉链；所述重组抗狂犬病毒抗体的轻链可变区融合有亮氨酸拉链；所述融合在重组抗狂犬病毒抗体的重链可变区的亮氨酸拉链为FOS亮氨酸拉链；所述融合在重组抗狂犬病毒抗体的轻链可变区的亮氨酸拉链为JUN亮氨酸拉链；所述重组抗狂犬病毒抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:11所示，所述重组抗狂犬病毒抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:12所示。2.根据权利要求1所述的基因工程抗体，其特征在于，所述编码所述抗狂犬病毒抗体的重链可变区的核酸，其核苷酸序列如SEQIDNO:3所示；所述编码所述FOS亮氨酸拉链的核酸，其核苷酸序列如SEQIDNO:4所示。3.根据权利要求1所述的基因工程抗体，其特征在于，所述编码所述抗狂犬病毒抗体的轻链可变区的核酸，其核苷酸序列如SEQIDNO:6所示；所述编码所述JUN亮氨酸拉链的核酸，其核苷酸序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：孔维，吴永革，李状，谷铁军，程月，陈晓旭，席华龙，
申请(专利权)人：长春百克生物科技股份公司，吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22