本发明专利技术公开了一种人源化抗人脑钠肽中和性基因工程抗体3C1制备方法，包括：将噬菌体粒基因3C1用NocI和NotI双酶切后插入到pET22b质粒构建成重组质粒pET22b-3C1；转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS得到基因工程菌pET22b-3C1/BL21(DE3)pLysS；经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达、纯化，复性后得到重组目的蛋白3C1。本发明专利技术还公开了人脑钠肽的中和性基因工程抗体3C1在制备脑性盐耗综合征等颅脑疾病的药物中的应用。本发明专利技术人脑钠肽的中和性基因工程抗体3C1的制备方法具有快速、成本低、人源化等优点，且适合工业化生产。
【技术实现步骤摘要】
人脑钠肽的中和性基因工程抗体3C1及其制备方法和应用
本专利技术涉及基因工程领域，具体是用基因工程方法生产一种能够快速中和血浆中脑钠肽成分的基因工程抗体及其制备方法，及其在脑性盐耗综合征治疗中的应用。
技术介绍
脑性盐耗综合征(cerebral salt wasting syndrome, CSWS)是颉脑疾病常并发的一种严重危害患者生命健康的临床综合征，主要表现为:低血钠、高尿钠和低血容量，其发病率较高，尤其是在重度颅脑外伤和各种原因所致的蛛网膜下腔出血(subarachnoidhemorrhage，SAH)患者中发病率更高。研究表明，CSWS的发病为中枢神经系统通过分泌脑钠尿肽(brain natriuretic peptide, BNP)影响肾脏对钠的重吸收而引起。 血液循环中的BNP为含32个氨基酸的多肽，最初从猪脑中分离提取，后来发现心脏亦能合成与分泌，而且浓度比脑内高。此外它也存在于肺、肾上腺等组织中。BNP有强大的利尿利钠、扩血管、降血压的作用。在脑组织，BNP主要在下丘脑合成，这部分脑组织受损时能大量释放BNP，以缓解颅内高压。过度分泌的BNP常常导致患者出现低血钠、高尿钠和低血容量，危及生命。 CSffS患者的基本治疗原则是:补充血容量和保持正钠平衡。然而补充钠盐只能缓解症状，并不能减少钠从肾脏的继续丢失，效果往往不佳。部分学者曾试用盐皮质激素-醋酸氟氢可的松来治疗低钠血症，虽然它能增加肾脏对钠的从吸收，改善患者症状，但这类药物可引起严重的低血钾和高血糖症状。因此，发展新的治疗途径来快速中合血液中的BNP对于CSWS的治疗具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术首次提出了一种能够快速中和血浆中脑钠肽成分的基因工程抗体(3C1)及其制备方法和应用。本专利技术的目的是通过基因工程技术制备抗血浆脑钠肽的基因工程抗体。该新型抗体是完全人源化的，可特异性中和血浆中脑钠肽，适用于脑性盐耗综合征相关性疾病的治疗。人源化是指，抗体基因全部由人类抗体基因所编码，可大大减少异源抗体对人类机体造成的免疫副反应。 本专利技术提出了一种中和人脑钠肽的基因工程抗体3C1的制备方法，包括以下步骤: a)将从噬菌体抗体文库淘筛获得的能特异性识别脑钠肽的噬菌体粒基因(3C1)用NocI和NotI双酶切后插入到pET22b质粒，构建成重组质粒pET22b_3Cl ;将pET22b-3Cl (氨苄青霉素抗性)重组质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3)pLysS得到基因工程菌pET22b-3Cl/BL21(DE3)pLysS。 b)将基因工程菌pET22b-3Cl/BL21 (DE3)pLysS涂板，挑取单克隆菌至2YT培养基中，37°C培养过夜，按1: 100比例转接后继续培养至OD6tltol ^ 0.4，加ImM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导4个小时；离心收集菌体，超声破菌，获得包涵体后洗涤、溶解，取上清过N1-NTA亲和柱，纯化产物进行复性处理，获得高纯度、高活性的目的蛋白。 其中，所述步骤b)中2YT培养基的成分为胰蛋白胨1.6g，酵母提取物Ig和氯化钠0.5g溶于IL蒸馏水中。 其中，所述步骤b)中将经离心获得含重组蛋白3C1的菌体先重悬于pH8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐中，随后与100 μ g/ml溶菌酶混合，于30°C裂解30分钟，于4°C进行超声破菌，经12000r/min离心15min获得包涵体。 其中，所述步骤b)中洗涤步骤中采用的洗涤液成分为:含2mol/L尿素的50mmol/L pH8.0Tris-HCl，0.5mol/L氯化钠及2% TritonX-100 (v/v)，溶解步骤中采用的裂解液成分为:含 8mol/L 尿素的 100mmol/L pH8.0Tris-HCl, 0.5mol/L 氯化钠，5mmol/L β -疏基乙醇及Smmol /I,咪唑。 其中，所述复性处理过程为:将1mg经N1-NTA亲和柱纯化得到的变性基因工程抗体3C1逐滴加入到10ml复性液中，4°C过夜后，用透析缓冲液及PBS于4°C分别透析12小时，获得有活性的重组蛋白3C1 ;其中，所述复性液成分为:含2mol/L尿素的100mmol/LpH8.0Tris-HCl及0.5mol/L L-精氨酸,所述透析液成分:含20nmol/L氯化钠的80mmol/LpH8.0Tris-HCl 及 0.4mol/L 尿素。 其中，所述基因工程菌pET22b-3Cl/BL21 (DE3) pLysS的脱氧核苷酸序列如SEQ IDN0.1所示,氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。 本专利技术还提出的人脑钠肽的中和性基因工程抗体3C1具有特异性中和脑钠肽活性的人源化单抗的体外活性。所述人脑钠肽的中和性基因工程抗体3C1通过间接酶联免疫吸附法(ELISA)，检测3C1与BNP的特异性结合；通过直接竞争ELISA法检测BNP多肽对3C1的中和效应；通过点杂交法(dot-blot)检测3C1对BNP的检测灵敏度达到10ng。 根据本专利技术制备方法得到的人脑钠肽的中和性基因工程抗体3C1，其基因全长为717bp，对应239个氨基酸，单链抗体分子量约为25128.82 ;等电点预测值为9.28，为碱性蛋白；二级结构预测显示3C1含45% α螺旋，39% D折叠，5% β转角；三维结构预测显示3C1重链(VH)和轻链(VL)形成一个疏水口袋，Linker游离于此结构之外，符合单链抗体(scFv)的结构特点，明显具有抗原结合位点的空间构象。 本专利技术还提出一种人脑钠肽的中和性基因工程抗体3C1在制备治疗脑性盐耗综合征的药物中的应用。 本专利技术通过运用基因工程技术和噬菌体表面展示技术，直接从人抗体基因库中筛选能与人脑钠肽抗原特异性结合的抗体，获得其抗体基因并表达，用作临床脑性盐耗综合征的治疗。 本专利技术人脑钠肽的中和性基因工程抗体3C1的制备方法具有快速、成本低、人源化等优点，且适合工业化生产。根据本专利技术方法制备得到的人脑钠肽的中和性基因工程抗体3C1可用于治疗脑性盐耗综合征等颅脑相关性疾病。 【附图说明】 图1所示为重组质粒pET22b_3Cl示意图。 图2所示为本专利技术人脑钠肽的中和性基因工程抗体3C1的纯化图； 图3所示为本专利技术人脑钠肽的中和性基因工程抗体3C1的三维空间蛋白结构图； 图4所示为本专利技术人脑钠肽的中和性基因工程抗体3C1与BNP特异性结合的间接ELISA检测结果； 图5所示为本专利技术人脑钠肽的中和性基因工程抗体3C1被BNP特异性中和的竞争ELISA检测结果； 图6所示为本专利技术人脑钠肽的中和性基因工程抗体3C1对BNP检测灵敏度的点杂交检测结果。 【具体实施方式】 结合以下具体实施例和附图，对本专利技术作进一步的详细说明。实施本专利技术的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本专利技术没有特别限制内容。 本专利技术的中和人脑钠肽的基因工程抗体的制备方法，包括以下具体步骤: a)人源性抗体3C1的基因工程菌pET22b_3Cl/BL21 (DE3) pLysS的构建 将从人源性噬菌体抗体文库中获得的能特异性识别脑钠本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种人脑钠肽的中和性基因工程抗体3C1的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：a)将特异性识别脑钠肽的噬菌体粒基因3C1用NocI和NotI双酶切后插入到pET22b质粒中，构建成重组质粒pET22b‑3C1；将所述重组质粒pET22b‑3C1转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS，得到基因工程菌pET22b‑3C1/BL21(DE3)pLysS；b)将所述基因工程菌pET22b‑3C1/BL21(DE3)pLysS涂板，挑取单克隆菌至2YT培养基中，37℃培养过夜，按1∶100比例转接后继续培养至OD600nm≈0.4，加1mM异丙基‑β‑D‑硫代吡喃半乳糖苷诱导4个小时；离心收集菌体，超声破菌，获得包涵体后洗涤、溶解，取上清过Ni‑NTA亲和柱，纯化产物进行复性处理，获得重组目的蛋白3C1。
【技术特征摘要】
1.一种人脑钠肽的中和性基因工程抗体3C1的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: a)将特异性识别脑钠肽的噬菌体粒基因3C1用NocI和NotI双酶切后插入到pET22b质粒中，构建成重组质粒pET22b-3Cl ;将所述重组质粒pET22b-3Cl转化大肠杆菌BL21 (DE3)pLysS，得到基因工程菌 pET22b-3Cl/BL21 (DE3)pLysS ； b)将所述基因工程菌pET22b-3Cl/BL21(DE3)pLysS涂板，挑取单克隆菌至2YT培养基中，37°C培养过夜，按1: 100比例转接后继续培养至OD6tltol ^ 0.4，加ImM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导4个小时；离心收集菌体，超声破菌，获得包涵体后洗涤、溶解，取上清过N1-NTA亲和柱，纯化产物进行复性处理，获得重组目的蛋白3C1。2.根据权利要求1所述人脑钠肽的中和性基因工程抗体3C1的制备方法，其特征在于，所述步骤b)中2YT培养基的成分为胰蛋白胨1.6g，酵母提取物Ig和氯化钠0.5g溶于IL蒸馏水中。3.根据权利要求1所述人脑钠肽的中和性基因工程抗体3C1的制备方法，其特征在于，所述步骤b)中将经离心获得含重组蛋白3C1的菌体先重悬于pH8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐中，随后与100 μ g/ml溶菌酶混合，于30°C裂解30分钟，于4°C进行超声破菌，经12000r/min离心15min获得包涵体。4.根据权利要求1所述人脑钠肽的中和性基因工程抗体3C1的制备方法，其特征在于，所述步骤b)中洗漆步骤中采用的洗漆液成分为:含2mol/L尿素的50mmol/LpH8.0Tris-HCl，0.5mol/L氯化钠及2% TritonX-100 (v/v)，溶解步骤中采用的裂解液成分为:含 8mol/L 尿素的 100mmol/L ρΗ8.0Tris-HCl, 0.5mol/L 氣化纳，5mmol/L ...
【专利技术属性】
技术研发人员：张巍，唐健，
申请(专利权)人：华东师范大学，
类型：发明
国别省市：上海;31
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