一种能够防治猪蓝耳病的生物活性分子-抗菌肽Cecropin D制造技术

本发明专利技术公开了一种新型的生物活性分子-抗菌肽Cecropin D在制备抗PRRSV病毒和/或防治猪蓝耳病药物中的应用。首先合成抗菌肽Cecropin D的基因序列引物并表达出抗菌肽Cecropin D，然后通过抗大肠杆菌DH5α实验验证其抗菌活性。进一步，在Marc-145细胞水平上，通过qRT-PCR、Western-Blot、TCID50检测及IFA等方法研究其对HP-PRRSV的抗病毒作用，进一步在病毒吸附、进入细胞和进入细胞后2h、4h四个过程阐述其抗病毒机制。结果显示，本发明专利技术所述方法制得的抗菌肽Cecropin D有很好抗HP-PRRSV病毒效果，有望成为新型的防治猪蓝耳病的生物活性分子。

【技术实现步骤摘要】
一种能够防治猪蓝耳病的生物活性分子-抗菌肽CecropinD
本专利技术属于分子生物学
更具体地，涉及一种能够防治猪蓝耳病的生物活性分子抗菌肽CecropinD。
技术介绍
猪繁殖与呼吸综合征（Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS）又称猪蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcinereproductiveandrespiratorysyndromeviruse，PRRSV）引起，PRRS主要引起妊娠母猪流产、死胎、木乃伊胎、弱仔及各年龄阶段猪特别是仔猪呼吸道症状，特征性病变为间质性肺炎，死亡率极高，是一种高度接触性的全球性的重要传染病。该病最早于1987年在美国爆发，随后蔓延到欧洲，我国于1996年分离到该病毒。目前，根据基因组序列和抗原性差异，将PRRSV分为两种基因型，一种以LelystadVirus（LV）毒株为代表的欧洲型，另一种以ATCCVR-2332毒株为代表的美洲型。在我国，PRRSV主要以美洲型为主，但据报道也分离到欧洲型毒株。2006年，我国爆发了猪高热病，对养猪业造成严重的经济损失，后来将此毒株定义为高致病型毒株（Highlypathogenicporcinereproductiveandrespiratorysyndromeviruse，HP-PRRSV），目前，高致病性猪蓝耳病（Highlypathogenicporcinereproductiveandrespiratorysyndrome，HP-PRRS）是对养猪业损害最大的疾病之一，由于该病毒具有免疫抑制性、抗体依赖增强性、持续性感染、病毒血症维持时间长等特点，目前没有很好的疫苗和药物可以防控蓝耳病。PRRSV属于尼多病毒目（Nidovirales）、动脉炎病毒科（Arteriviridae）、动脉炎病毒属（Arterivirus）成员，电镜下观察病毒粒子呈球形或椭圆形，有囊膜。病毒基因组为一条单股正链RNA，全长约为15Kb，含有5′和3′非编码区，中间为10个开放阅读框（openreadingframe，ORF），其中ORF2-7分别翻译病毒糖蛋白（glycoproteinGP）GP2a、GP2b、GP3、GP4、GP5、GP5a、M及N蛋白。其中最重要的是GP5和N蛋白，它们不仅是病毒粒子的主要组成部分，而且在病毒粒子的包装、成熟、免疫逃避及抗体诱导中产生重要的作用。PRRS的防控是目前我国乃至世界的难题。PRRS难于防控主要表现在以下几方面：（1）嗜巨噬细胞性和免疫抑制性疾病，PRRSV主要感染猪的肺泡巨噬细胞（Porcinealveolarmacrophages，PAMs），PAMs是免疫细胞，破坏PAMs，从而破坏机体免疫系统，从而引起免疫抑制；（2）抗原变异性，目前PRRSV变异较快，弱毒疫苗的使用是促使病毒变异的一个原因，疫苗没有交叉保护力；（3）抗体依赖性增强，PRRSV的感染会刺激机体产生抗体，但低效价的抗体不但不能中和病毒，反而对病毒的增殖有促进作用；（4）病毒持续性感染，PRRSV感染后，能够长时间在猪体内检测到病毒血症；（5）混合感染，目前临床上混合感染，特别是圆环病毒、副猪嗜血杆菌等与PRRSV的混合感染，使PRRSV防控难上加难。目前PRRS防控主要有灭活疫苗和弱毒疫苗，临床上用的较多的是弱毒疫苗。其中灭活疫苗有如下缺点：（1）需要大剂量接种或应用浓缩抗原，免疫期短，常需强化接种；（2）不能引起局部免疫，以致细胞免疫的作用弱；（3）产生完全免疫力需要2～3周，不利于紧急预防接种与降低疫苗费用；（4）存在灭活不彻底和散毒的可能。而弱毒疫苗存在毒力返强、重组及潜在感染的危险。故疫苗在防制PRRSV中暴露出越来越多的问题。1975年，瑞典科学家Boman等从惜古比天蚕蛹中诱导分离得到一种抗菌肽，并命名为Cecropin。天蚕素CecropinD（CD）是家蚕体内cecropins家族的一种抗菌小肽，由36个氨基酸残基组成，分子量为3.9KDa，含有2段α-螺旋，中间由一段结节部位相连，N端经常是一些强碱性氨基酸残基，C端则由非极性氨基酸残基构成疏水性区域。目前已证明CD对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌及真菌有抗微生物学活性。而关于抗菌肽CecropinD（CD）是否具有抗病毒活性，尤其是否具有抗PRRSV病毒的作用，至今还未见有相关的研究或报道。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有猪蓝耳病防治技术的不足，提供一种能够防治猪蓝耳病的生物活性分子抗菌肽CecropinD（CD）。该抗菌肽CD对PRRSV有很好的抗病毒作用，尤其是针对高致病型毒株HP-PRRSV仍然具有显著的抗病毒作用，在猪蓝耳病的防治方面具有很好的应用前景。本专利技术的目的是提供抗菌肽CecropinD（CD）在制备抗PRRSV病毒药物中的应用，尤其是抗HP-PRRSV药物中的应用。本专利技术另一目的是提供抗菌肽CecropinD（CD）在制备防治猪蓝耳病药物中的应用。本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：公开了抗菌肽CecropinD在制备抗PRRSV病毒药物中的应用，所述抗菌肽CecropinD的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。优选地，所述PRRSV病毒为高致病性蓝耳病病毒HP-PRRSV。公开了抗菌肽CecropinD在制备防治猪蓝耳病药物中的应用，所述抗菌肽CecropinD的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。优选地，所述猪蓝耳病是由高致病性蓝耳病病毒HP-PRRSV引起的猪蓝耳病。SEQIDNO.1所示序列为：WNPFKELERAGQRVRDAIISAGPAVATVAQATALAK。另外，上述抗菌肽CecropinD含有2段α-螺旋，中间由一段结节部位相连；N端是强碱性氨基酸残基，C端由非极性氨基酸残基构成疏水性区域。所述抗菌肽CecropinD使用剂量范围为100mg/L～300mg/L。包括有效量的抗菌肽CecropinD的抗PRRSV病毒药物，也应在本专利技术的保护范围之内。优选地，所述PRRSV病毒为高致病性蓝耳病病毒HP-PRRSV。该药物的剂型可以为注射制剂或口服制剂。本专利技术首先合成抗菌肽CecropinD的基因序列引物，并利用毕赤酵母表达系统表达抗菌肽CecropinD（CD），然后通过抗大肠杆菌DH5α实验验证其抗菌活性，进一步在Marc-145细胞和PAMs细胞水平上，通过qRT-PCR、Western-Blot、TCID50检测及IFA等方法研究其对HP-PRRSV毒株的抗病毒活性，并通过病毒吸附、进入细胞和进入细胞后2h、4h四个过程研究阐述其抗病毒机制。结果显示，本专利技术所述方法制得的抗菌肽CecropinD有很好抗HP-PRRSV病毒效果，有望成为新型的防治猪蓝耳病的生物活性分子。另外，对于抗菌肽CecropinD的表达，为了获得稳定高效表达抗菌肽CD的酵母工程菌，本专利技术通过不同浓度ZeocinTM抗性筛选高拷贝质粒，通过碳源、氮源、发酵罐溶氧量、PH值及表达时间对发酵条件进行了摸索，为筛选高效稳定表达CD工程菌奠定了基础，而且本专利技术表达抗菌肽CD的表达载体为pGAPZαA，此载体不需要甲醇诱导，从而使表达更加方便，且表达量更高本文档来自技高网...

【技术保护点】
抗菌肽Cecropin D在制备抗PRRSV病毒药物中的应用，其特征在于，所述抗菌肽Cecropin D的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.抗菌肽CecropinD在制备抗PRRSV病毒药物中的应用，其特征在于，所述抗菌肽CecropinD的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，所述PRRSV病毒为高致病性蓝耳病病毒HP-PRRSV。2.抗菌肽CecropinD在制备防治猪蓝耳病药物中的应用，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘小红，郭春和，陈瑶生，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：广东;44