作为CMV疫苗的条件性复制型巨细胞病毒制造技术

本发明专利技术涉及使用遗传修饰的条件性复制缺陷型CMV诱导针对巨细胞病毒(CMV)的免疫应答的方法。本发明专利技术的方法可以用于治疗和/或预防原发性CMV感染、由潜伏CMV的再活化引起的感染、和以前已经遇到的CMV的不同毒株的重叠感染。本发明专利技术也涉及一种复制缺陷型CMV，其已经被重组改变以允许病毒复制的外部控制。本发明专利技术也包括包含所述复制缺陷型CMV的组合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】作为CMV疫苗的条件性复制型巨细胞病毒专利
本专利技术涉及使用遗传修饰的条件性复制缺陷型CMV诱导针对巨细胞病毒(CMV)的免疫应答的方法。本专利技术也涉及已经重组地改变以实现病毒复制的外部控制的CMV。本专利技术也包括包含所述复制缺陷型CMV的组合物。专利技术背景巨细胞病毒(CMV)也被称作人疱疹病毒5型(HHV-5)，是被归类为疱疹病毒科的β亚科的一个成员的疱疹病毒。根据疾病控制和预防中心(CentersforDiseaseControlandPrevention)，发现CMV感染颇为普遍地存在于人类群体中，据估算40-80％的美国成人群体已经受感染。该病毒主要通过体液传播，且经常从怀孕母体传递给胎儿或新生儿。CMV感染在大多数个体中是潜伏性的，尽管病毒活化可以导致高热、寒战、疲劳、头痛、恶心和脾肿大。尽管大多数人CMV感染是无症状的，但是免疫受损个体(诸如HIV-阳性的患者、同种异体移植患者和癌症患者)或其免疫系统尚未充分发育的人(诸如新生儿)中的CMV感染可以是特别有问题的(Mocarski等人,Cytomegalovirus,在FieldVirology中,2701-2772,编辑:Knipes和Howley,2007)。这样的个体中的CMV感染除了其它有害病况外还可以造成严重病态，包括肺炎、肝炎、脑炎、结肠炎、葡萄膜炎、视网膜炎、失明和神经病。另外，妊娠期间的CMV感染是出生缺陷的主要原因(Adler,2008J.ClinVirol,41:231;Arvin等人,2004ClinInfectDis,39:233;Revello等人,2008JMedVirol,80:1415)。CMV在体内感染多种细胞，包括单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、嗜中性粒细胞、内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、神经元、平滑肌细胞、肝细胞和基质细胞(Plachter等人.1996,Adv.VirusRes.46:195)。尽管临床CMV分离物在多种细胞类型中复制，但是实验室毒株AD169(Elek和Stern,1974,Lancet1:1)和Towne(Plotkin等人,1975,Infect.Immun.12:521)几乎排它地在成纤维细胞中复制(Hahn等人,2004,J.Virol.78:10023)。由连续传代和所述病毒在成纤维细胞中的最终适应引起的趋性限制，被规定为减毒的标志物(Gerna等人,2005,J.Gen.Virol.86:275;Gerna等人,2002,J.GenVirol.83:1993;Gerna等人,2003,J.GenVirol.84:1431;Dargan等人,2010,J.GenVirol.91:1535)。已经将造成人CMV实验室毒株中的上皮细胞、内皮细胞、白细胞和树突细胞趋性损失的突变定位至3个可读框(ORF)：UL128、UL130和UL131(Hahn等人,2004,J.Virol.78:10023;Wang和Shenk,2005J.Virol.79:10330;Wang和Shenk,2005ProcNatlAcadSciUSA.102:18153)。生化和重构研究表明，UL128、UL130和UL131装配到gH/gL支架上以形成五聚体gH复合物(Wang和Shenk,2005ProcNatlAcadSciUSA.102:1815;Ryckman等人,2008J.Virol.82:60)。该复合物在病毒粒子中的恢复会修复实验室毒株中的病毒上皮趋性(Wang和Shenk,2005J.Virol.79:10330)。已经将内皮和上皮趋性损失推测为以前评价的疫苗诸如Towne的缺陷(Gerna等人,2002,J.GenVirol.83:1993;Gerna等人,2003,J.GenVirol.84:1431)。得自天然CMV感染的人受试者的血清中的中和抗体的对抗病毒上皮进入的活性比对抗成纤维细胞进入的活性高超过15倍(Cui等人,2008Vaccine26:5760)。具有原发性感染的人会快速地形成针对病毒内皮和上皮进入的中和抗体，但是仅缓慢地形成针对病毒成纤维细胞进入的中和抗体(Gerna等人,2008J.Gen.Virol.89:853)。此外，在来自接受Towne疫苗的人受试者的免疫血清中不存在对抗病毒上皮和内皮进入的中和活性(Cui等人,2008Vaccine26:5760)。更近年来，描述了一组得自4位具有HCMV感染的供体的人单克隆抗体，并且得自该组的更有效的中和克隆识别五聚体gH复合物的抗原(Macagno等人,2010J.Virol.84:1005)。专利技术概述本专利技术涉及条件性复制缺陷型CMV(rdCMV)，以及rdCMV在治疗患者中的CMV感染或与这样的感染有关的病理学和/或降低其可能性的组合物和方法中的用途。本文描述的rdCMV包含编码一种或多种融合蛋白的核酸，所述融合蛋白包含与去稳定蛋白（destabilizingprotein）融合的必需蛋白。在没有稳定剂存在下，所述融合蛋白会被降解。因而，可以在允许复制的条件下(即，在有稳定剂存在下)在组织培养物中培养rdCMV，但是当施用给患者时(在没有稳定剂存在下)，会减少复制，且优选地阻止复制。本专利技术的一个实施方案是条件性复制缺陷型CMV。所述rdCMV包含编码一种或多种融合蛋白的核酸，所述融合蛋白包含与去稳定蛋白融合的必需蛋白。编码野生型必需蛋白的核酸不再存在于所述rdCMV中，且因而所述融合蛋白是病毒复制所必需的。在优选的实施方案中，所述必需蛋白选自：IE1/2、UL51、UL52、UL79和UL84，且所述去稳定蛋白是FKBP或其衍生物。本专利技术的另一个实施方案是，包含分离的rdCMV和药学上可接受的载体的组合物。所述组合物可以进一步包含佐剂，所述佐剂包括、但不限于ISCOMATRIX®佐剂和磷酸铝佐剂。本专利技术的另一个实施方案是，所述rdCMV组合物在患者中诱导针对CMV的免疫应答的用途。通过施用本专利技术的rdCMV，可以预防性地或治疗性地处理患者。预防性处理会提供足够的保护性免疫以减小CMV感染的可能性或严重程度，所述CMV感染包括原发性感染、复发性感染(即，由潜伏CMV的再活化引起的那些感染)和重叠感染(即，由与患者以前经历的CMV毒株不同的CMV毒株的感染引起的那些感染)。在具体实施方案中，给育龄女性、特别是青春期早期女性接种疫苗以减小在妊娠期间CMV感染(原发性感染、复发性感染或重叠感染)的可能性，并从而减小CMV向胎儿传播的可能性。可以进行治疗性处理以减小当前的CMV感染的持续时间/严重程度。本专利技术的另一个实施方案是，制备本专利技术的rdCMV的方法，所述方法包括：在有Shield-1存在下，在上皮细胞诸如ARPE-19细胞(ATCC登记号CRL-2302)上繁殖所述rdCMV。在一些实施方案中，在存在于微载体或其它高密度细胞培养系统上的上皮细胞上繁殖所述rdCMV。附图说明图1A-1B显示了具有恢复的五聚体gH复合物表达的CMV毒株的构建示意图。(A)用于操纵AD169病毒基因组的可自切割的细菌人工染色体(BAC)的制备策略。(B)用于恢复它的表达的UL131中的移码突变的修复。(C)用cre重组酶基因替本文档来自技高网...

【技术保护点】
条件性复制缺陷型CMV，其包含：(a) 五聚体gH复合物，其包含UL128、UL130、UL131、gH和gL；和(b) 核酸，其编码必需蛋白和去稳定蛋白之间的融合蛋白，其中所述必需蛋白选自IE1/2、UL51、UL52、UL79和UL84。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.09.09 US 61/5326671.条件性复制缺陷型巨细胞病毒(CMV)，其包含：(a)五聚体gH复合物，其包含UL128、UL130、UL131、gH和gL；和(b)核酸，其编码必需蛋白IE1/2和去稳定蛋白之间的第一融合蛋白以及UL51和去稳定蛋白之间的第二融合蛋白，其中所述去稳定蛋白是FK506-结合蛋白(FKBP)或包含氨基酸取代F36V和L106P的FKBP衍生物，其中野生型IE1/2和UL51不再存在，且其中所述CMV是由于UL131基因中的突变的修复而已经恢复gH复合物表达的减毒毒株。2.根据权利要求1所述的条件性复制缺陷型CMV，其中所述去稳定蛋白是包含氨基酸取代F36V和L106P的FKBP衍生物。3.根据权利要求1或2所述的条件性复制缺陷型CMV，其中(a)所述第一融合蛋白是SEQIDNO:1；且(b)所述第二融合蛋白是SEQIDNO:3。4.根据权利要求3所述的条件性复制缺陷型CMV，其中(a)所述第一融合蛋白由SEQIDNO:2编码；且(b)所述第二融合蛋白由SEQIDNO:4编码。5.根据权利要求1或2所述的条件性复制缺陷型CMV，其中所述CMV是由于UL131基因中的突变的修复而已经恢复gH复合物表达的AD169。6.组合物，其包含根据权利要求1-5中的任一项所述的条件性复制缺陷型CMV和药学上可接受的载体。7.根据权利要求6所述的组合物，其进一步包含佐剂。8.免疫学上有效量的权利要求6或权利要求7所述的组合物...

【专利技术属性】
技术研发人员：TM付，D王，MB梅迪，
申请(专利权)人：默沙东公司，
类型：发明
国别省市：美国;US