一种利用含血清培养液体外构建的3D模型及其构建方法技术

本发明专利技术公开一种利用含血清培养体系在体外构建的3D模型及其构建方法，涉及组织工程学生物材料技术领域，由于该3D模型的种子细胞选择多样，体外构建重复性佳，可实现产业化制备；同时，使用含血清培养体系，提供细胞所需营养的同时，减少了因子的添加。该模型是应用细胞生物学和工程学原理，使用组织分离的原代角膜上皮细胞，或角膜缘干细胞，或永生化角膜上皮细胞，或原代口腔黏膜上皮细胞，或口腔黏膜鳞状癌细胞株TR146，经体外扩增后，采用含血清培养液，及液下‑气液面分段培养法，使其复层化，形成体外3D模型。

【技术实现步骤摘要】
一种利用含血清培养液体外构建的3D模型及其构建方法
本专利技术属于组织工程学生物材料
，具体涉及一种利用含血清培养体系在体外构建的3D模型及其构建方法。
技术介绍
本专利技术中3D模型是应用细胞生物学和工程学原理，将少量种子细胞经体外扩增后构建而成，其结构与正常人角膜上皮结构高度类似，由下而上的结构依次为基底层、棘层、颗粒层、棘层，均无角质层，具有完整的上皮结构，且表达角膜相关角蛋白。该体外构建的3D模型主要用作眼刺激体外检测，对小分子化合物、活性蛋白、医疗器械、化学品、化妆品等产品的安全性进行评价。化学物直接接触或者暴露于眼部，会引发刺激性以及局部毒性。因此，眼表刺激性风险评估是危害评价以及风险规避程序中非常需要的一项。传统方法中对新型化合物的眼刺激潜在风险的评估主要依赖于体外的兔眼实验，这种方法耗时耗力、且成本较高。因此，寻找快速、经济的化合物筛选方法成为该领域的一项迫切需求，并激发了大量的关于眼表刺激性风险评估的体外替代方法的建立的相关工作的开展，例如牛角膜不透明度及渗透性检测，鸡胚尿囊膜实验等，上述技术通过一定程度的组合可以实现体外眼刺激性评价，但却都无法完全实现体外兔眼刺激实验的替代。近年来，随着体外器官培养技术的发展，基于体外细胞培养构建的3D重组角膜上皮模型，在眼刺激风险评价领域表现出特有的趋势。体外构建的3D角膜上皮模型，类似于人体角膜上皮的三维结构，其不仅可以更为真实的反映人体对化学物的响应，准确给出化学物刺激性的预测，对于化合物筛选的种类也具有更宽的应用范畴，除了不同功效目的的剂型开发，也包括化妆品具体成分的危害评价。目前，采用体外构建3D重组角膜模型进行的眼刺激性检测已被国际认可，2015年OECD指南492即给出了采用该模型的一种替代方法。目前，国际上主要有三种商业化的体外重组角膜上皮模型，第一款EpiOcular™(MatTek,MA,USA)，HCE(SkinEthic,France)以及CORNEA-MODEL（Labcyte，Japen）。其中，MatTek的EpiOcularTM以人源的表皮角质化细胞作为种子细胞，体外培养形成类似于角膜上皮结构的模型，虽然该模型在眼刺激性动物替代评价方法中扮演着重要的角色，但非角膜细胞系并不能完全等同于人角膜。Labcyte的CORNEA-MODEL采用正常的人角膜上皮细胞系进行构建，体外培养形成角膜上皮结构；角膜上皮细胞是体外研究细胞分化、信号传导、细胞稳态信号通路的模式工具，也可以用来构建体外三维的角膜上皮组织模型，但是，可用角膜组织的有限来源，加之角膜细胞自身短暂的生命周期以及快速的分化，使得角膜上皮细胞体外培养难度大，且非常耗时。许多尝试增长角膜上皮细胞体外培养周期的工作都有开展，例如病毒转染，端粒酶逆转录基因转染等，SkinEthic的HCE模型采用永生化的角膜上皮细胞系作为种子细胞进行培养，形成多细胞层的角膜上皮组织类似物，其结构上和角膜黏膜非常类似。中国专利201410062366申请公开了一种简易角膜缘干细胞分离和体外培养试剂盒及方法，采用该方法进行角膜缘干细胞分离和体外培养，操作简单，干细胞得率高，所得原代干细胞损伤少，增值能力强，体外培养成功率高，重现性好。中国专利03150375.6申请公开了一种组织工程自体角膜上皮及其制备方法，该方法将来源于患者自体的角膜上皮干细胞和角膜上皮细胞在体外扩增和分化后，接种到纤维蛋白生物支架上进行培养，在体外构建组织工程自体角膜上皮。中国专利200410019341.X申请公开了一种角膜缘干细胞组织工程复合体及其制备方法，该方法采用去除上皮的羊膜作为载体，以3T3成纤维细胞作为滋养层，在体外构建组织工程角膜复合体。中国专利200410019342.4申请公开了一种人成纤维细胞滋养的人角膜缘干细胞组织工程产品及制备方法，该方法采用去除上皮的羊膜作为载体，以人成纤维细胞作为滋养层，在体外构建组织工程角膜复合体。中国专利201019018004.1申请公开了一种组织工程角膜的制备方法，该方法采用表皮干细胞和多能基质干细胞为种子细胞，经体外扩增培养后种植在脱细胞天然角膜基质的两面，再经体外诱导培养形成组织工程角膜。角膜上皮模型的细胞来源包括胚胎干细胞、间充质干细胞、皮肤干细胞以及口腔黏膜上皮细胞等，其作为种子细胞的动物实验及临床应用已有了报道并取得了突破性的进展，尤其是对于口腔黏膜上皮细胞的研究，目前已经成为热点。目前在临床治疗中，使用口腔黏膜上皮细胞构建生物膜片移植治疗眼表疾病，该方法已成为临床治疗中常用方法。自口腔黏膜分离的上皮细胞与表皮角质化细胞相比处于较低的分化阶段，由于其细胞循环周期相对短暂，体外培养时间也会缩短，且延长培养时间也会维持非角化状态；其次，取活组织后残留的疤痕不明显，使口腔成为获取活组织的一个理想场所。Shigeru及Nakamura等指出，口腔黏膜上皮组织由5~6层细胞构成，具有基底层、棘层、颗粒层，无角质层，并且具有桥粒、半桥粒等紧密连接结构，该组织结构与角膜组织结构相似；并且研究发现口腔黏膜上皮细胞表达非角质层特异蛋白CK4、CK13，及角膜特异蛋白CK3。Yasutaka等研究也指出，口腔黏膜上皮细胞表达角膜特异蛋白CK3，非角质层特异蛋白CK4、CK13，而角质层特异蛋白CK1、CK10无表达，其表达情况与角膜中角蛋白的表达情况相同。口腔黏膜上皮细胞在临床治疗上的成功应用，说明口腔黏膜上皮细胞可以作为角膜上皮细胞理想替代物用于眼表重建，表明口腔黏膜上皮细胞具有替代角膜细胞构建体外模型的潜能。中国专利200610128698.0申请公开了一种自体角膜上皮的制备方法，该方法采用原代培养患者自体的口腔黏膜组织细胞3~15天，对所得细胞进行传代扩增培养7~30天，再接种到纤维蛋白生物支架上进行培养构建，最终制备成角膜上皮，应用于临床治疗。但目前使用口腔黏膜细胞构建的角膜模型，其构建时间长，体外构建一批模型需长达一个月时间，过长的构建时间会增加过程中的不可控因素，影响模型的稳定性；需要滋养层，为上皮层提供营养；多应用于临床治疗。目前，体外构建组织工程角膜大多应用于临床治疗，而制约组织工程角膜移植的瓶颈是构建载体，因此组织工程角膜的研究主要集中在构建载体上，其构建体系也更加适合载体，且大多需要滋养层为上皮层提供营养。另外，目前使用角膜细胞构建的角膜模型，其构建时间长，体外构建一批模型需长达一个月时间，过长的构建时间会增加过程中的不可控因素，影响模型的稳定性。
技术实现思路
本专利技术实施例提供了一种利用含血清培养体系在体外构建的3D模型及其构建方法，由于该3D模型的种子细胞选择多样，体外构建重复性佳，可实现产业化制备；同时，使用含血清培养体系，提供细胞所需营养的同时，减少了因子的添加；并且构建培养体系更适合上皮细胞的增殖分化，使细胞无须基质和支架也能复层分化良好，保证了模型的正常复层化，从而形成了和人体角膜上皮高度类似的连接结构，并正常表达了角膜上皮相关蛋白。本
技术实现思路
如下：一种3D模型，所述模型是一种利用含血清培养液体外构建的3D模型及其构建方法，是应用细胞生物学和工程学原理，使用组织分离的原代角膜上皮细胞，或角膜缘干细胞，或永生化角膜上皮细胞，或原代口腔黏膜上本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用含血清培养体系在体外构建的3D模型，其特征在于，所述模型是应用细胞生物学和工程学原理，使用组织分离的原代角膜上皮细胞，或角膜缘干细胞，或永生化角膜上皮细胞，或原代口腔黏膜上皮细胞，或口腔黏膜鳞状癌细胞株TR146，经体外扩增后，采用含血清培养液，及液下‑气液面分段培养法，使其复层化，形成体外3D模型。

【技术特征摘要】
1.一种利用含血清培养体系在体外构建的3D模型，其特征在于，所述模型是应用细胞生物学和工程学原理，使用组织分离的原代角膜上皮细胞，或角膜缘干细胞，或永生化角膜上皮细胞，或原代口腔黏膜上皮细胞，或口腔黏膜鳞状癌细胞株TR146，经体外扩增后，采用含血清培养液，及液下-气液面分段培养法，使其复层化，形成体外3D模型。2.根据权利要求1所述的利用含血清培养体系在体外构建的3D模型，其特征在于，所述含血清培养液中含5%~20%的胎牛血清FBS。3.一种利用含血清培养液体外构建3D模型的体外构建方法，其特征在于，所述利用含血清培养液体外构建3D模型的体外构建方法包括以下方法步骤：步骤一、细胞的准备取原代角膜上皮细胞，或角膜缘干细胞，或永生化角膜上皮细胞，或原代口腔黏膜上皮细胞，或口腔黏膜鳞状癌细胞株TR146，复苏扩增后，使用P4~P20代细胞，以胰酶消化制成单细胞悬液，调整细胞密度5.0×104个/mL～5.0×106个/mL，接种于培养瓶中，加含5%~20%胎牛血清的培养液Ⅰ培养，轻轻晃动培养瓶，使细胞分散均匀后，置于37℃、5%CO2条件下培养；所述培养液Ⅰ，为DMEM，其所含葡萄糖含量为1.0～4.5g/L，谷氨酰胺含量为0.2g/L～20.0g/L；步骤二、3D模型的液下接种培养取对数生长期细胞，以培养液Ⅱ制成单细胞悬液，调整细胞密度为5.0×104个/mL～5.0×106个/mL，以200μL/室的体积，接种于小室内，将小室置于模型培养皿内，每皿添加适量培养液Ⅱ，使小室内外液面高度一致，进行浸没式培养；置于37℃、5%CO2条件下培养0.5～2小时，后转入液下培养，培养时间为1～3天，每天换液；所述培养液Ⅱ，是以DMEM：F12含量为3:1～1:3的培养基为基础培养基，添加胎牛血清浓度为5%～20%，维甲酸浓度为4～10μg/mL，人表皮生长因子浓度为0.1～10.0ng/mL，胰岛素浓度为...

【专利技术属性】
技术研发人员：何欣，李潇，卢永波，
申请(专利权)人：广东博溪生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44