纯化衍生自多能干细胞的细胞的方法技术

本发明专利技术涉及使多能干细胞分化的方法。具体地讲，本发明专利技术提供采用独特的表面标记物对被分化为表达胰腺内分泌谱系特征性标记物的细胞的细胞进行表征的方法。本发明专利技术还提供对表达胰腺内分泌谱系特征性标记物的细胞进行富集或分选的方法。本发明专利技术还提供对可能污染由本发明专利技术方法形成的表达胰腺内分泌谱系特征性标记物的细胞群的细胞进行清除，从而降低移植后体内肿瘤形成发生率的方法。

Method for purifying cells derived from pluripotent stem cells

The present invention relates to methods for differentiation of pluripotent stem cells. In particular, the present invention provides a method for characterizing cells that are differentiated into expressed pancreatic endocrine lineage characteristic markers using unique surface markers. The present invention also provides methods for enriching or sorting cells expressing characteristic markers of the endocrine lineage of the pancreas. The invention also provides for the elimination of pollution may be formed by the method of the invention is the expression of pancreatic endocrine lineage markers characteristic of cells of cells, thereby reducing the incidence of tumor formation after transplantation in vivo method.

【技术实现步骤摘要】
纯化衍生自多能干细胞的细胞的方法本申请是分案室申请，其母案的中国申请号是201180011846X，国际申请号是PCT/US2011/026443，申请日是2011年2月28日。相关专利申请的交叉引用本专利申请要求于2010年3月1日提交的系列号为61/309,193的临时申请的优先权。
本专利技术涉及使多能干细胞分化的方法。具体来说，本专利技术提供利用独特的表面标记物对被分化为表达胰腺内分泌谱系特征性标记物的细胞的细胞进行表征的方法。本专利技术还提供富集或分选表达胰腺内分泌谱系特征性标记物的细胞的方法。本专利技术还提供清除可能污染由本专利技术方法形成的表达胰腺内分泌谱系特征性标记物的细胞群的细胞、从而降低移植后体内肿瘤形成的发生率的方法。
技术介绍
多能干细胞具有产生构成所有体细胞组织和器官的分化细胞类型的潜能。大量能够发挥类似于人类胰岛作用的细胞的生产有利于使用细胞疗法治疗糖尿病。因此，需要生产这些衍生自多能干细胞的细胞，以及纯化此类细胞的可靠方法。多能干细胞和衍生自多能干细胞的细胞群上存在的蛋白质与其他细胞表面标记物，可用于制备分离和离析这些群体的试剂。细胞表面标记物还可用于这些细胞的进一步表征。在一个例子中，WO2009131568公开了纯化肠道内胚层细胞的方法，该方法包括：a)将衍生自多能干细胞的包含肠道内胚层细胞的细胞群暴露于能结合肠道内胚层细胞上表达的细胞表面标记物的配体，其中所述细胞表面标记物选自CD49e、CD99、CD165和CD334；以及b)将肠道内胚层细胞与不能结合该配体的衍生自多能干细胞的细胞分离，从而纯化所述肠道内胚层细胞。又如，WO2010000415公开了将能结合抗原TNAP的抗体或该抗体的功能片段单独使用，或与能结合CD56的抗体或该抗体的功能片段联合使用，来分离具有脂肪细胞、软骨细胞和胰腺细胞分化潜能的干细胞。又如，US7371576公开了一种选择性细胞表面标记物的发现，该标记物使得可以选择具有很高的分化为产胰岛素细胞或产胰岛素细胞团的倾向的独特胰腺干细胞亚群。又如，US7585672公开了从衍生自人类胚胎干细胞的培养物中富集内胚层和胰腺谱系细胞的方法，该方法包括以下步骤：(a)培养人类胚胎干细胞的未受损集落以形成完整的、未受损的被脏层卵黄囊(VYS)细胞围绕的胚状体，其中人类胚胎干细胞表达Oct-4、表面阶段特异性胚胎抗原-3/4(SSEA3/4)和上皮细胞粘附分子(EpCAM)；(b)在允许胚状体细胞分化为包含内胚层和胰腺谱系细胞的细胞群的条件下培养步骤(a)的胚状体；(c)将步骤(b)的细胞群分散为单细胞；(d)对SSEA3/4表达阳性细胞进行选择以从步骤(c)的细胞中清除未分化细胞；(e)对SSEA-1表达阳性细胞进行选择以从步骤(d)的剩余细胞中清除VYS细胞；以及(f)在步骤(e)剩余细胞中选择EpCAM表达阳性细胞以富集内胚层和胰腺谱系细胞。US7585672还公开了从衍生自人类胚胎干细胞的培养物中富集内胚层和胰腺谱系细胞的方法，该方法包括以下步骤：(a)培养人类胚胎干细胞的未受损集落以形成完整的、未受损的被脏层卵黄囊(VYS)细胞围绕的胚状体，其中人类胚胎干细胞表达Oct-4、表面阶段特异性胚胎抗原-3/4(SSEA3/4)和上皮细胞粘附分子(EpCAM)；(b)在允许胚状体细胞分化为包含内胚层和胰腺谱系细胞的细胞群的条件下培养步骤(a)的胚状体；(c)用有效量的成纤维细胞生长因子10(FGF10)处理步骤(b)的细胞群；以及(d)将步骤(c)的细胞群分散为富含内胚层和胰腺谱系细胞的单细胞；(e)对SSEA-3/4表达阳性细胞进行选择以从步骤(d)的细胞中清除未分化干细胞；(f)对SSEA-1表达阳性细胞进行选择以从步骤(e)的细胞中清除VYS细胞；以及(g)在步骤(f)的剩余细胞中选择EpCAM表达阳性细胞以富集内胚层和胰腺谱系细胞。US7585672还公开了用于构建没有致瘤能力的干细胞衍生细胞群的富集方法，该方法包括以下步骤：(a)培养人类胚胎干细胞的未受损集落以形成完整的、未受损的被脏层卵黄囊(VYS)细胞围绕的胚状体，其中人类胚胎干细胞表达Oct-4、表面阶段特异性胚胎抗原-3/4(SSEA3/4)和上皮细胞粘附分子(EpCAM)；(b)在允许胚状体细胞分化为包含内胚层和胰腺谱系细胞的细胞群的条件下培养步骤(a)的胚状体；(c)将步骤(b)的细胞群分散为单细胞；(d)对SSEA3/4表达阳性细胞进行选择以从步骤(c)的细胞中清除未分化细胞；(e)对SSEA-1表达阳性细胞进行选择以从步骤(d)的细胞中清除VYS细胞；以及(f)在步骤(e)的剩余细胞中选择EpCAM表达阳性细胞，由此得到的细胞注入免疫低下小鼠时不形成畸胎瘤。又如，US20050260749公开了从衍生自干细胞的培养物中富集内胚层和胰腺谱系细胞的方法，该方法包括以下步骤：培养干细胞到形成胚状体；以及在胚状体中选择物种相应(appropriate)细胞表面阶段特异性胚胎抗原的表达，并且仅培养不表达细胞表面阶段特异性抗原的胚状体以分化为内胚层和胰腺细胞。又如，US20100003749公开了分离的胰腺干细胞群，其中胰腺干细胞群富含CD133+CD49f+胰腺干细胞。US20100003749还公开了从原代胰腺组织中分离胰腺干细胞，通过以下步骤进行：从胰腺细胞、胰腺衍生细胞或胃肠衍生细胞群中选择CD133+、CD49f+或CD133+CD49f+的细胞；清除CD15+的细胞，其中剩余的细胞为CD15-；将剩余的细胞引入包含一种或多种生长因子的无血清培养基；以及使剩余细胞在培养基中增殖。又如，Dorrell等人阐述道：“我们研发了一组新型的用于分离和研究人类胰腺所有主要细胞类型的细胞表面标记物。在用未受损的或解离的人类胰岛对Balb/C小鼠进行消减免疫后选择杂交瘤细胞，并且通过免疫组织化学和流式细胞仪来评估细胞型特异性与细胞表面反应性。通过胰岛（泛内分泌(panendocrine)或α特异性的）和非胰岛类胰腺细胞亚群（外分泌与腺管）上的表面抗原的特异性结合来鉴定抗体。这些抗体单独或结合使用，以通过FACS从原代人类胰腺分离α、β、外分泌腺或腺管细胞群，并且表征人类胰腺制品的详细细胞组成。它们也用于证实人类胰岛扩增培养物源于非内分泌细胞，并且胰岛素表达水平可以通过亚群体分选和转录因子Pdx-1与ngn3过表达而增加至最高达正常胰岛细胞的1%，这相对于之前采用此培养体系得到的结果是个进步。这些方法使得可以分析和分离功能上不同的、具有细胞治疗潜力的胰腺细胞群。”（StemCellResearch,Volume1,Issue3,September2008,Pages155-156（《干细胞研究》，第1卷，第3期，2008年9月，第155-156页））。又如，Sugiyama等人阐述道：“我们最终鉴定了两种抗原，分别称为CD133和CD49f，可用于从小鼠中纯化NGN3+细胞。CD133（又称prominin-1）为功能未知的跨膜蛋白，并且是造血祖细胞和神经干细胞的已知标记物。CD49f又称α6整联蛋白，并且是层粘连蛋白的受体亚基。通过联合使用能识别CD133和CD49f的抗体，我们分级分离了四种本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备富集的表达胰腺内分泌谱系特征性标记物的细胞群的方法，包括：a. 使多能干细胞群分化为表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞群，b. 使所述表达定形内胚层谱系特征性标记物的所述细胞群分化为表达原肠管谱系特征性标记物的细胞，c. 使所述表达原肠管谱系特征性标记物的细胞分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞群，和d. 使所述表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞群分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标记物的细胞群，其中该方法另外包括如下一种或多种：富集表达原肠管谱系特征性标记物的细胞群，或富集表达胰腺内分泌谱系特征性标记物的细胞群。

【技术特征摘要】
2010.03.01 US 61/3091931.一种制备富集的表达胰腺内分泌谱系特征性标记物的细胞群的方法，包括：a.使多能干细胞群分化为表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞群，b.使所述表达定形内胚层谱系特征性标记物的所述细胞群分化为表达原肠管谱系特征性标记物的细胞，c.使所述表达原肠管谱系特征性标记物的细胞分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞群，和d.使所述表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞群分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标记物的细胞群，其中该方法另外包括如下一种或多种：富集表达原肠管谱系特征性标记物的细胞群，或富集表达胰腺内分泌谱系特征性标记物的细胞群。2.根据权利要求1所述的方法，其中该方法包括富集表达原肠管谱系特征性标记物的细胞群。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述表达原肠管特征性标记物的细胞群是通过将所述表达原肠管谱系特征性标记物的细胞群与能够结合Lif受体的试剂接触来富集。4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述表达胰腺内分泌谱系特征性标记物的细胞群的富集是通过与至少一种能够结合选自如下的标记物的试剂接触：CD9、CD13、CD15、CD47、CD56、CD73、CD117、CD133、CD184、CD200、CD318、CD326和SSEA4。5.根据权利要求1所述的方法，其中多能干细胞是来自确立的多能细胞系的细胞。6.根据权利要求1所述的方法，其中该方法还包括富集表达胰腺内分泌谱系特征性标记物的细胞群。7.根据权利要求6所述的方法，其中表达胰腺内分泌谱系特征性标记物的细胞群的富集是通过分离一种或多种下述群从而产生富集的细胞群：i)对于CD56呈阳性并对于CD13呈阴性的表达胰腺内分泌谱系特征性标记物的细胞群，ii)对于CD133呈阴性的表达胰腺内分泌谱系特征性标记物的细胞群，iii)其为CD49cLo的表达胰腺内分泌谱系特征性标记物的细胞群，iv)对于CD56呈阳性并其为CD15Lo的表达胰腺内分泌谱系特征性标记物的细胞群，v)对于CD56和CD57两者呈阳性的表达胰腺内分泌谱系特征性标记物的细胞群，vi)对于CD184呈阳性的表达胰腺内分泌谱系特征性标记物的细胞群，或vii)对于SSEA-4...

【专利技术属性】
技术研发人员：F卡拉努，A雷扎尼亚，
申请(专利权)人：詹森生物科技公司，
类型：发明
国别省市：美国,US