一种犊牛小肠上皮细胞体外培养方法技术

本发明专利技术公开了一种犊牛小肠上皮细胞体外培养方法。取犊牛小肠，将肠管撑开器导入肠管并将肠管撑开，用PBS液冲洗肠道胎粪直至流出的液体清亮，然后用止血钳封闭肠管一端，注满蛋白酶消化液后再封闭肠管另一端，置于摇床37℃消化1‑1.5小时，收集液体离心洗涤两次，最后加入培养液接种培养；12‑24小时后细胞贴壁生长，3‑4天后有约90％细胞贴壁，即为小肠上皮细胞。由于本发明专利技术中蛋白酶消化液直接注入肠腔内，不与肠道外壁接触，所以不会将肠道外壁的成纤维细胞和肌肉细胞消化下来，最大程度地保证了上皮细胞的纯度。

【技术实现步骤摘要】
一种犊牛小肠上皮细胞体外培养方法
本专利技术涉及一种生物培养技术，具体是一种犊牛小肠上皮细胞体外培养方法。
技术介绍
在哺乳动物中，小肠是食物进行消化吸收的主要场所，而小肠黏膜上皮细胞是肠道的功能细胞，参与肠道食糜的消化、吸收、免疫屏障和应激反应等，并与肠道的内、外分泌功能有密切关系。因此，体外分离培养小肠上皮细胞对于研究小肠生理功能、营养物质吸收机制、药物作用以及各种致病因素作用下的病理生理改变具有重要意义。一些发达国家已经在医药开发等领域建立了多种小肠上皮细胞株，但其动物种属仅限于小鼠、大鼠和人；而对于畜牧业动物的细胞营养代谢方面的研究才刚刚起步，尤其在牛上的研究报道更为少见，这主要是由于迄今为止还没有建立成熟的小肠上皮细胞体外培养方法。目前，牛小肠上皮细胞培养主要存在两个问题。(1)取样牛只选择。研究中发现，利用成年牛进行小肠上皮细胞体外培养成功率极低，这是因为成年牛肠道内存有大量食糜和微生物菌群，即使用大量磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗也有可能残留细菌，造成原代培养污染；而且成年牛肠道上皮细胞已高度分化，几乎不能贴壁生长。(2)上皮细胞纯度低。原代培养主要采用蛋白酶消化法分离小肠隐窝上皮细胞。操作时将小肠纵向剪开，PBS液冲洗后加入蛋白酶消化液处理，待肠道隐窝从肠壁脱落后加入培养液终止消化，收集液体离心洗涤，最后接种培养(LoretS,RusuD,EIMoualijB,TaminiauB,HeinenE,DandrifosseG,MainilJ.Preliminarycharacterizationofjejunocyteandcolonocytecelllinesisolatedbyenzymaticdigestionfromadultandyoungcattle.ResVetSci.2009,87(1):123-32)。尽管这种方法能分离获得大量上皮细胞，但缺点也是显而易见的，因为蛋白酶消化肠道黏膜组织时，不可避免也会将肠管外壁的平滑肌细胞、成纤维细胞分离下来，造成培养的细胞中既有上皮细胞又有成纤维样细胞，上皮细胞混杂于成纤维样细胞中生长。(3)分离成纤维细胞和上皮细胞步骤繁琐且影响细胞活性。为了分离成纤维细胞和上皮细胞，传统方法一般要加入胰酶消化后观察有成纤维样细胞松动脱落但上皮细胞未松动时终止消化，加入培养液后轻轻吹打尽量将脱落的成纤维样细胞去掉，然后将残留的细胞传代培养，待细胞贴壁80-90％后再用胰酶消化处理去掉残余的成纤维样细胞，这样造成纯化过程中上皮细胞多次传代培养，使细胞活性和分泌功能降低。
技术实现思路
为了克服上述小肠上皮细胞体外培养方法的缺点，本专利技术提供了一种新的小肠上皮细胞的体外培养方法。本专利技术(1)肠道组织取样时选择刚出生、未吸允过母乳或其他任何食物的健康犊牛。由于犊牛的肠道环境理论上是无菌的，而且犊牛肠道上皮细胞大部分处于未分化状态，增殖能力强，易于贴壁生长和传代培养。(2)不将肠管纵向剪开，而是利用特制的撑开器(图1)将肠管撑开，充分冲洗肠道内胎粪，注入蛋白酶消化液后获得大量游离的隐窝，接种后贴壁生长即为小肠上皮细胞。本专利技术的技术方案是：一种犊牛小肠上皮细胞的体外培养方法，其特征是，取犊牛小肠，将肠管撑开器导入肠管并将肠管撑开，用PBS液冲洗肠道胎粪直至流出的液体清亮，然后用止血钳封闭肠管一端，注满蛋白酶消化液(每100mlDMEM液中加入50±5mg胶原蛋白酶，40±4mg中性蛋白酶，充分溶解后经0.22μm滤器过滤后使用)后再封闭肠管另一端，置于摇床37℃消化1-1.5小时，收集液体离心洗涤两次，最后加入培养液接种培养；12-24小时后细胞贴壁生长，3-4天后有约90％细胞贴壁，即为小肠上皮细胞。具体包括以下步骤：(1)培养液配制每450-500ml细胞培养液(DMEM/F12)中加入50-60ml胎牛血清(FBS)、5-10ml青链霉素混合液、0.1-0.2g的谷胱甘肽、0.2-0.5mg的胰岛素、0.01-0.05mg的胰岛素样生长因子和0.01-0.05g的丁酸钠；然后经0.22微米滤膜过滤后分装到灭菌的离心管中，每管40-45毫升，放置4℃保存，两周内用完。细胞培养前0.5-1小时将培养液放在37℃水浴锅中预热。(2)小肠上皮细胞培养从屠宰场内采集刚出生、未吸允过母乳及其他任何食物的健康犊牛的小肠，放在含1％青链霉素混合液的PBS液中带回实验室。在超净台内用剪刀去除肠系膜、脂肪组织，然后用镊子夹住肠管一端，手持撑开器缓缓导入肠管直至将肠管完全撑开，用10-20ml注射器抽取PBS液冲洗肠管，待流出的液体清亮后用止血钳封闭肠管一端，用注射器注满蛋白酶消化液(每100mlDMEM液中加入50±5mg胶原蛋白酶，40±4mg中性蛋白酶，充分溶解后经0.22μm滤器过滤后使用)，再用止血钳将肠管另一端封闭，置于摇床37℃消化1-1.5小时。收集液体并加入等体积的培养液终止消化，置于50ml离心管中离心(150-200×g、5分钟)，之后去掉上清液加入含2％山梨糖醇的培养液离心洗涤两次，最后加入培养液重悬离心管底部沉淀物，按800-1000个隐窝/ml接种到培养瓶中，置于37℃、5％CO2饱和湿度培养箱内培养。12-24小时后细胞贴壁生长，3-4天后有约90％细胞贴壁。本专利技术的肠管撑开器，它包括前置环、螺旋钢圈、后置环和手柄依次连接；其中手柄与后置环的连接为可拆卸连接。使用时，将前置环放入小肠的一端，转动手柄使螺旋钢圈旋转缓缓进入小肠，将后置环留在小肠的另一端。注入蛋白酶消化液后取下手柄，用止血钳封闭肠管。本专利技术的有益效果是：(1)本专利技术采用专用的肠道撑开器将肠管撑开，注入PBS液后能快速将肠道内胎粪冲洗干净；而且在加入蛋白酶消化液后，消化液与肠道黏膜充分接触，能快速、均匀地将隐窝消化下来，获得大量游离的隐窝，接种后贴壁生长即为小肠上皮细胞。由于本专利技术中蛋白酶消化液直接注入肠腔内，不与肠道外壁接触，所以不会将肠道外壁的成纤维细胞和肌肉细胞消化下来，最大程度地保证了上皮细胞的纯度，也省略了分离成纤维细胞和上皮细胞的步骤，大大简化了方法。(2)本专利技术在培养液中添加对上皮细胞增殖有明显促进作用的能量物质谷胱甘肽、促进细胞分化的胰岛素、胰岛素样生长因子和丁酸钠，使培养环境更利于上皮细胞增殖、分化，因此在接种后3-4天即可获得90％左右细胞贴壁。(3)本专利技术采用肠管撑开器具有以下好处：将肠道全部撑开，使肠道内胎粪冲洗和蛋白酶消化这两个步骤进行地比较彻底，不容易留死角，且能获得大量游离的隐窝；同时冲洗和消化的速度快，不影响细胞活性。附图说明图1为本专利技术专用的肠管撑开器的结构示意图；图2为犊牛小肠上皮细胞采用实施例1的方法培养3天后的100×照片；图中：1、前置环，2、螺旋钢圈，3、后置环，4、手柄。具体实施方式如图1所示，本专利技术的肠管撑开器包括前置环1、螺旋钢圈2、后置环3和手柄4依次连接，其中前置环1、螺旋钢圈(类似弹簧，图1中设有4节螺旋钢圈)2和后置环为固定连接；手柄4通过可拆卸的方式(如螺纹连接、卡扣连接等)与后置环3可拆卸连接在一起。使用时，将前置环放入小肠的一端，螺旋钢圈旋转缓缓进入小肠，将后置环留在小肠的另一端。上述肠管撑开器的两端采用圆环形式便于将肠管撑本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种犊牛小肠上皮细胞的体外培养方法，其特征是，取犊牛小肠，将肠管撑开器导入肠管并将肠管撑开，用PBS液冲洗肠道胎粪直至流出的液体清亮，然后用止血钳封闭肠管一端，注满蛋白酶消化液后再封闭肠管另一端，置于摇床37℃消化1‑1.5小时，收集液体离心洗涤，最后加入培养液接种培养；所述蛋白酶消化液为：每100ml DMEM液中加入50±5mg胶原蛋白酶，40±4mg中性蛋白酶，充分溶解、过滤后使用。

【技术特征摘要】
1.一种犊牛小肠上皮细胞的体外培养方法，其特征是，取犊牛小肠，将肠管撑开器导入肠管并将肠管撑开，用PBS液冲洗肠道胎粪直至流出的液体清亮，然后用止血钳封闭肠管一端，注满蛋白酶消化液后再封闭肠管另一端，置于摇床37℃消化1-1.5小时，收集液体离心洗涤，最后加入培养液接种培养；所述蛋白酶消化液为：每100mlDMEM液中加入50±5mg胶原蛋白酶，40±4mg中性蛋白酶，充分溶解、过滤后使用。2.如权利要求1所述的一种犊牛小肠上皮细胞的体外培养方法，其特征是，所述肠管撑开器，它包括前置环、螺旋钢圈、后置环和手柄依次连接；其中手柄与后置环的连接为可拆卸连接。3.如权利要求1或2所述的一种犊牛小肠上皮细胞的体外培养方法，其特征是，所述培养液为：每450-500mlDMEM/F12细胞培养液中加入50-60ml胎牛血清、5-10ml青链霉素混合液、0.1-0.2g的谷胱甘肽、0.2-0.5mg的胰岛素、0.01-0.05mg的胰岛素样生长因子和0.01-0.05g的丁酸钠。4.如权利要求3所述的一种犊牛小肠上皮细胞的体外培养方法，其特征是，...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭秀文，刘倚帆，宋恩亮，靳青，游伟，赵洪波，张相伦，
申请(专利权)人：山东省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：山东,37