一种参环毛蚓肠上皮细胞系及其建立方法技术

本发明专利技术涉及一种参环毛蚓肠上皮细胞系，其特征在于，其保藏号为CCTCC—C201294。本发明专利技术所述的参环毛蚓肠上皮细胞系不仅其中成活的细胞数高，而且细胞的生命力强、传代培养分裂增长速度快，可用于药品或营养保健品的开发。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及未分化的非人类细胞，具体涉及一种参环毛蚓肠上皮细胞系。
技术介绍
参环毛蝴Pheretima aspergiIIum(E. Perrier)来源于矩蝴科环毛蝴属，是《中华人民共和国药典》2010版“地龙”项下收载的4种原动物之一。因其主产于广东和广西两地，故被称为“广地龙”。由于广地龙疗效确切，药材加工精细讲究而被业内公认为品质最优。中药地龙在《中华人民共和国药典》收录品种还有柿盲环毛Pheretima pectinifera (Michaelsen)、威廉环毛蝴Pheretima guillelmi (Michaelsen)以及通俗环毛蝴PheretimaV μ lgaris (Chen)的干燥体，后三种习称“沪地龙”。地龙性寒、味咸，归肝、脾、膀胱经，具有清热息风、通经络、平喘、利尿之功。主治高热惊痫，气虚两滞，半身不遂，肺热哮喘，小便不利及热痹等症。近20年来，国内外有关地龙的化学成分、药理作用、临床应用的研究报道相对较多。大量研究表明，地龙不仅含有丰富的营养成分，还含有多种药理活性成分，其药理作用几乎涉及人体各个系统，主要有降压、抗血栓、抗心律失常、抗癌、增强免疫、抗溃疡、解热镇痛、镇静、平喘、抗菌等作用。由此可见，地龙不论作为药品还是营养保健品开发利用，在经济、社会和生态方面都有巨大的效益潜力。目前地龙药材大多仍靠野生资源，加上不同环境条件以及采收加工技术等的影响，造成药材质量极不稳定，特别是重金属超标一直难以控制的问题。近年，在国家科技部“十五”国家重大科技攻关项目“广地龙规范化养殖研究”的资助下，我们曾随机抽取12批在我国市场上销售的广地龙药材进行了重金属含量调查，由中国广州分析测试中心的检测报告(编号2004093019)表明其中7批次的镉(Cd2+)含量超过中华人民共和国对外贸易经济合作部发布的《药用植物及制剂进出口绿色行业标准》中规定的限量，其超过的倍数从23倍至143倍不等。由此可见，市场上广地龙重金属超标问题令人堪忧，已严重制约其出口量和临床用药安全。为进一步深化参环毛蚓的重金属富集机制，制定降低或消除广地龙重金属超标的研究，建立参环毛蚓的细胞系是至关重要的一个环节，目前关于蚯蚓细胞培养报道并不多，还存在大量空白，仅涉及到的品种是正蝴科Lumbricidae的陆正蝴Lumbricus terrestis和赤子爱胜蚓Eisenia foetida，且为70年代和90年代的初步尝试，距今时间较久，研究进展方面见到零星报道。《广州中医药大学学报》2011年5月第28卷第3期刊载了题为“参环毛蚓细胞原代培养灭菌方法的研究” 一文，该文所公开的参环毛蚓细胞原代培养灭菌方法虽然也是常见的动物细胞培养方法，但是在培养过程及后续的观察中发现其存在细胞传代时分裂增长慢，且容易出现早期细胞凋亡的缺陷。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种改进的参环毛蚓肠上皮细胞系，该细胞系不仅长时间保藏成活率高、活力好，而且在传代培养时仍然表现出快速分裂增长的活性。本专利技术解决上述问题的技术解决方案是一种参环毛蚓肠上皮细胞系，其特征在于，其保藏号为CCTCC一C201294。上述参环毛蚓肠上皮细胞系的建立方法由以下步骤组成(I)将收集野外采集的参环毛蚓置于实验室泥土(温度28°C、PH=4. 5、土壤含水量21. 5%)中，用蒸馏水养殖2周后，置于垫有用蒸馏水湿润的滤纸的烧杯中，保持适宜的温度28 0C，湿度60%，每天换滤纸I次，吐泥3 4天；(2)取吐泥3 4天后的参环毛蚓于超净台上，用75%酒精体表消毒后解剖，将获得的肠道部位用LBSS缓冲液冲洗，再用抗生素组合液灭菌2 3min ;弃抗生素组合液得到的肠道部分先加入体积为肠道体积的10倍的Thermolysin酶解液酶解20min后弃去酶解液，再加入体积为肠道体积的10倍的Collagenase Type I酶解液酶解20分钟,过100目的细胞筛除去较大的组织碎片，然后以1000r/min离心5min,弃上清,收集细胞；其中，·所述的抗生素组合液是将青霉素钠、硫酸链霉素和硫酸庆大霉素加入到LBSS溶液混合制成的，所制得的抗生素组合液中，青霉素钠的浓度为200U/ml，硫酸链霉素的浓度为400 μ g/ml，硫酸庆大霉素的浓度为300U/ml，两性霉素B的浓度为5 μ g/ml ；所述的Thermolysin酶解液是将Thermolysin粉末加入到浓度为IOm mol/ml的HEPES溶液中过滤灭菌混合制成,所制得的Thermolysin酶解液中Thermolysin的浓度为25 μ g/mL ；所述的Collagenase Type I 酶解液是将 Collagenase Type I 粉末加入到 HBSS(Ix)溶液中过滤灭菌而成，所制的Collagenase Type I酶解液中Collagenase Type I的浓度为O. 2mg/mL ；(3)往收集的细胞中加入培养液调整细胞密度为lxl05/ml接种于透气培养瓶中，置于28°C，5%C02培养箱中培养，同时，观察细胞生长情况，当细胞贴壁面积达到80%时，吸去细胞培养液，用LBSS冲洗I 2遍；如果培养到第五天细胞贴壁面积还达到80%，便进行半量更换液培养液继续培养；其中所述的培养液由91. 55%的F12DMEM、5%的FBS、1%的EGF溶液、1%的insulin试剂、O. 75%的浓度为40000U/ml的硫酸庆大霉素、O. 2%的青霉素钠试齐[J、0. 4%的硫酸链霉素试剂、O. 1%的两性霉素B试剂组成，其中，所述的EGF溶液是把EGF粉末加入到的浓度为IOm mol/ml的HEPES缓冲溶液中制成，所制得的EGF溶液中EGF的浓度为2000ng/ml ；所述的insulin试剂是把insulin粉末加入到F12DMEM中制成，所得到insulin试剂中insulin的浓度为200 μ g/ml ；所述的青霉素钠试剂是将青霉素钠溶解到LBSS中制成，其中青霉素钠在试剂的浓度为 100000U/ml ；所述的硫酸链霉素试剂是将硫酸链霉素溶解到LBSS中制成，其中硫酸链霉素在试剂中的浓度为800000 μ g/ml ；所述的两性霉素B试剂是将两性霉素B溶解到DMSO中制成，其中两性霉素B在试剂中的浓度为5000 μ g/ml ；(4)然后，刮下上皮样细胞克隆区域以外的细胞群，再往培养瓶加入传代培养液淹没贴壁面的细胞继续培养，直到上皮样细胞克隆区域达到85%以上，即得到所述的参环毛蚓肠上皮细胞系；其中所述的传代培养液是由体积百分比为91. 5%的F12DMEM、5%的FBS、1%的浓度为2000ng/ml EGF溶液；1%的浓度为200 μ g/ml insulin试剂；I. 45%青霉素-链霉素溶液(lx)，其中， 所述的EGF溶液是把EGF粉末加入到的浓度为IOm mol/ml的HEPES缓冲溶液中制成，所制得的EGF溶液中EGF的浓度为2000ng/ml ；所述的insulin试剂是把insulin粉末加入到F12DMEM中制成，所得到insulin试剂中insulin的浓度为200 μ g/ml。由于本专利技术所述的参环毛蚓肠上皮细胞系的构建方法在现有技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种参环毛蚓肠上皮细胞系，其特征在于，其保藏号为CCTCC—C201294。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李薇，侯雪芹，林小桦，喻良文，卢瑞珊，吴文如，
申请(专利权)人：广州中医药大学，
类型：发明
国别省市：