一种长双歧杆菌蛋白质、其制备方法及应用技术

本发明专利技术提供了一种来源于长双歧杆菌的粘附蛋白，并明确了其氨基酸序列；在此基础上基于遗传工程技术获得了一株该蛋白的表达菌株，并针对菌株及粘附蛋白的特性从诱导表达、层析纯化、超滤浓缩等方面进行创新性设计，进而获得了上述粘附蛋白的高效制备方法。进一步的，实验发现该粘附蛋白不仅能够粘附于肠上皮细胞，而且具有提升微生物抗生素敏感性的作用，基于这种有益的发现，确定了该蛋白作为抗生素抑菌增效剂的用途，从而扩展了其用途范围，同时提供了一种提升微生物药敏性的新途径。本发明专利技术基于严谨的实验手段获得了突出的技术效果，具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物
，具体涉及一种长双歧杆菌蛋白质、其制备方法及应用。
技术介绍
双歧杆菌作为肠道益生菌广为人知，近年来针对其肠道益生作用研究发现，双歧杆菌的某些代谢产物能够抑制其他微生物在肠道内壁的定植，进而降低病原微生物的侵害风险。该特征目前已经成为筛选双歧杆菌菌种、研发功能性益生菌菌剂的重要依据。现有技术研究发现，双歧杆菌对其他微生物定植于肠道内壁的抑制机制主要是通过分泌有机酸降低肠道pH值，调节肠道微生态环境，同时分泌胞外酶从而影响致病菌或细菌毒素的黏附位点及其特异性受体。此外，近年来有学者认为，由双歧杆菌自身黏附于肠道所引发的占位效应和空间位阻效应可能是阻碍致病菌黏附和入侵的一个重要因素。黏附蛋白作为双歧杆菌黏附并定植于胃肠道上皮的重要因子，其物质基础、代谢特性在现有技术中尚无明确结论，尽管现有技术中曾报道部分具有粘附性的双歧杆菌表达蛋白，但其是否就是菌体定植于肠道内壁的功能性物质尚不明确；此外，在明确获得一种双歧杆菌粘附蛋白的基础上，为实现进一步的应用，其表达量、纯化效率应当得到优化；再次，针对双歧杆菌粘附蛋白，应当进一步研究其生物学特性，从而为该粘附蛋白的其他用途奠定基础。长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)是双歧杆菌属的一种，属革兰氏阳性、无芽孢、不运动、厌氧性杆菌，广泛存在于人体尤其婴儿的肠道中，属于药品、微生态菌剂制备领域的常规菌种之一。r>
技术实现思路
本专利技术旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种长双歧杆菌蛋白质、其制备方法及应用，以解决现有技术中缺乏一种成分单一、结构明确的双歧杆菌粘附蛋白的技术问题。本专利技术要解决的另一技术问题是上述长双歧杆菌蛋白质制备方法不明确。本专利技术要解决的再一技术问题是当采用重组表达方法制备上述长双歧杆菌蛋白质时，其纯化效率较低。本专利技术要解决的又一技术问题是上述长双歧杆菌蛋白质的应用范围存在局限性。本专利技术要解决的又一技术问题是微生物对抗生素的敏感性有待提升。为实现以上技术目的，本专利技术采用以下技术方案：一种长双歧杆菌蛋白质，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。一种上述长双歧杆菌蛋白质的制备方法，包括以下步骤：1)制备长双歧杆菌蛋白质的重组大肠杆菌表达菌株；2)取步骤1)所述长双歧杆菌蛋白质的重组大肠杆菌表达菌株进行培养，至培养液OD600nm为0.6～0.9时加入诱导剂IPTG至终浓度为0.8～1.2mM，而后于35～39℃、震荡条件下诱导培养4～5h；3)收集菌体、破碎、收集上清；4)取步骤3)上清液，利用GST亲和层析纯化，收集洗脱液后超滤浓缩，脱盐，干燥，即得到所述长双歧杆菌蛋白质。作为优选，步骤3)所述的破碎是将菌体重悬于PBS缓冲液后，在冰浴条件下超声破碎20～30次，每次破碎的持续时间为2～4s，每2次破碎之间的时间间隔为4～6s。作为优选，步骤4)具体包括以下操作：a)取缓冲液A，以2.5～3.5mL/min的流速平衡谷胱甘肽琼脂糖树脂柱；b)取步骤2)上清液，以1～2mL/min的流速上样；c)取缓冲液B，以0.8～1.2mL/min的流速洗脱，收集洗脱峰处溶液即为洗脱液；d)取洗脱液超滤浓缩，而后过脱盐柱，再利用纯水以2.5～3.5mL/min的流速洗脱，收集洗脱峰处溶液即为第二洗脱液，而后冷冻干燥，即得到所述长双歧杆菌蛋白质；其中所述缓冲液A是含有1.5～2.5mMEDTA的PBS缓冲液；所述缓冲液B是含有1.5～2.5mMEDTA、15～25mM谷胱甘肽的PBS缓冲液；进一步优选的，步骤a)中用于平衡谷胱甘肽琼脂糖树脂柱的缓冲液A用量为25～35mL，更优的是30mL。作为优选，步骤1)中所述的震荡是150～200r/min转速的摇床培养，更优的是180r/min转速的摇床培养。一种长双歧杆菌蛋白质用于提升微生物对抗生素敏感性的应用；进一步优选的，是上述长双歧杆菌蛋白质作为抗生素抑菌增效剂的应用。作为优选，所述抗生素是β-内酰胺类抗生素；进一步优选的，所述β-内酰胺类抗生素可以是氨苄青霉素、青霉素G或头孢霉素。作为优选，所述抗生素是氨基糖苷类抗生素；进一步优选的，所述氨基糖苷类抗生素是卡那霉素。作为优选，所述抗生素是酰胺醇类抗生素；进一步优选的，所述酰胺醇类抗生素是氯霉素。作为优选，所述微生物是单核增生李斯特菌、大肠杆菌或鼠伤寒沙门氏菌。作为优选，所述应用是利用含有浓度为45～55μg/mL的、氨基酸序列为SEQIDNO:1的蛋白质溶液，以接触方式处理微生物；进一步优选的，被处理微生物在所述蛋白质溶液中的浓度是106CFU/mL；进一步优选的，所述处理时间是1.5～2.5h。在以上技术方案中，所述敏感性是指微生物受抗生素抑制的程度，所述提升微生物对抗生素敏感性，是指利用含有本专利技术长双歧杆菌蛋白质的介质孵育微生物后，被处理微生物在抗生素作用下抑菌效果更为显著。所述长双歧杆菌蛋白质，是说明自然环境下该蛋白来源于长双歧杆菌，而并不构成对该蛋白质技术特征的限定作用；在本专利技术中，该蛋白质的技术特征仅由其序列限定。所述长双歧杆菌蛋白质的重组大肠杆菌表达菌株，是指整合有本专利技术长双歧杆菌天然表达基因的重组大肠杆菌；其制备方法通常包括长双歧杆菌总DNA的提取，目的基因的扩增，扩增产物的纯化，目的基因及载体的酶切、连接，重组载体向大肠杆菌中的导入，重组子的筛选等步骤；实际制备方法可依据本领域的一般技术常识进行适应性设计。如前文所述，本专利技术可用于提升微生物对抗生素的敏感性。但利用本专利技术长双歧杆菌蛋白质处理后的物质并不必然予以抗生素处理，当予以抗生素处理时，其处理方法可采用以下方案：氨苄青霉素作用浓度为1～50μg/mL；青霉素G作用浓度为1～50μg/mL；头孢霉素作用浓度为1～50μg/mL；卡那霉素作用浓度为1～25μg/mL；氯霉素作用浓度为1～25μg/mL。本专利技术提供了一种来源于长双歧杆菌的粘附蛋白，并明确了其氨基酸序列；在此基础上基于遗传工程技术获得了一株该蛋白的表达菌株，并针对菌株及粘附蛋白的特性从诱导表达、层析纯化、超滤浓缩等方面进行创新性设计，进而获得了上述粘附蛋白的高效制备方法。进一步的，实验发现该粘附蛋白不仅能够粘附于肠上皮细胞，而且具有提升微生物抗生素敏感性的作用，基于这种有益的发现，确定了该蛋白作为抗生素抑菌增效剂的用途，从而扩展了其用本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种长双歧杆菌蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

【技术特征摘要】
1.一种长双歧杆菌蛋白质，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。
2.一种权利要求1所述长双歧杆菌蛋白质的制备方法，其特征在于包括以
下步骤：
1)制备长双歧杆菌蛋白质的重组大肠杆菌表达菌株；
2)取步骤1)所述长双歧杆菌蛋白质的重组大肠杆菌表达菌株进行培养，
至培养液OD600nm为0.6～0.9时加入诱导剂IPTG至终浓度为0.8～1.2mM，而后
于35～39℃、震荡条件下诱导培养4～5h；
3)收集菌体、破碎、收集上清；
4)取步骤3)上清液，利用GST亲和层析纯化，收集洗脱液后超滤浓缩，
脱盐，干燥，即得到所述长双歧杆菌蛋白质。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤3)所述的破碎是将
菌体重悬于PBS缓冲液后，在冰浴条件下超声破碎20～30次，每次破碎的持续时
间为2～4s，每2次破碎之间的时间间隔为4～6s。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤4)具体包括以下操
作：
a)取缓冲液A，以2.5～3.5mL/min的流速平衡谷胱甘肽琼脂糖树脂柱；
b)取步骤2)上清液，以1～2mL/min的流速上样；
c)取缓冲液B，以...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐锋，杨栋，魏华，武晓丽，蔚晓敏，吴姚平，
申请(专利权)人：南昌大学，
类型：发明
国别省市：江西;36