本发明专利技术公开了抑制产气荚膜梭菌感染的融合蛋白及其相关生物材料与应用。该融合蛋白为a)或b)或c)：a)由SEQ ID No.2的氨基酸序列组成的蛋白质；b)由SEQ ID No.2第51‑937位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；c)在a)或b)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白。该融合蛋白免疫动物后可使动物产生较高的血清抗体水平，并且可抵抗产气荚膜梭菌的攻击。该融合蛋白可溶性好，纯化简易，可作为诊断抗原、制备成单克隆抗体或进一步对蛋白功能与构象关系进行研究。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
中抑制产气荚膜梭菌感染的融合蛋白及其相关生物材料与应用。
技术介绍
产气荚膜梭菌(Clostridium Perfringens)也称魏氏梭菌，是一种重要的人畜共患病，该病原是创伤性气性坏疽和人类食物中毒以及羊快疫、羔羊痢疾、牛羊坏死性肠炎、牛羊肠毒血症的主要病原之一，对畜牧业造成了巨大的经济损失。产气荚膜梭菌主要的致病因素是其分泌的外毒素，种类多达13种，其中α、β和ε是最主要的外毒素，根据产生外毒素的种类不同，可将产气荚膜梭菌分为A、B、C、D、E这五个血清型。目前产气荚膜梭菌病的免疫主要通过传统的经过灭活的单价苗、多联苗或者类毒素疫苗而实现，这些传统疫苗虽然能够诱导动物产生一定的保护性抗体，但是它们存在安全性不高、稳定性差、免疫后副反应大等缺点，这些缺点大大限制了其应用，研发一种针对多种血清型的基因工程亚单位多价疫苗因而成为了世界各国研究者的重点研究目标。由于基因工程亚单位多价疫苗含有产生保护性免疫应答所必需的有效免疫成分，去除了与免疫无关的成分，因而相对于传统疫苗而言安全性、稳定性更好，同时也消除了传统疫苗成分中的热原与应激原、变应原等反应原，很好的解决了传统疫苗免疫后动物出现的副反应与炎性刺激反应等问题。宫旭颖等(宫旭颖等.产气荚膜梭菌α-β2-ε毒素融合蛋白在大肠杆菌中的表达及免疫原性研究.中国预防兽医学报.第37卷第2期2015年2月)利用PCR技术构建了含有α、β和ε融合基因的重组质粒，并且进行了α-β2-ε融合蛋白的诱导表达，为进一步研制多价基因工程亚单位苗提供了基因材料，为解决困扰我国畜牧业的动物坏死性肠炎和肠毒血症提供了一条新的途径。但是该重组质粒表达出的α-β2-ε融合蛋白为包涵体结构，且α-β2-ε融合蛋白的表达量占菌体总蛋白含量的18.4％。现有技术中对产气荚膜梭菌主要外毒素蛋白的表达与纯化方法相对复杂，表达产物通常以不溶性的包涵体形式存在，可溶性蛋白表达的报道在国内外非常少。因为包涵体中的表达产物不具有生物学活性，因而需要进行变性与复性处理。蛋白的变性与复性是一个极其复杂的过程，不同蛋白的复性条件各异，复性率往往很难提高。这是限制其应用的主要制约因素。采用可溶性表达方式可很好的克服这一问题。如何构建可溶性表达载体并且优化可溶性蛋白的高效表达方法，是本领域长期以来一直研究的热点课题。
技术实现思路
本专利技术所要解决的一个技术问题是如何获得抑制产气荚膜梭菌感染的可溶性蛋白
质疫苗。为解决上述技术问题，本专利技术提供了a)或b)或c)或d)的蛋白质：a)由SEQ ID No.2的氨基酸序列组成的蛋白质；b)由SEQ ID No.2第51-937位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；c)在a)或b)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白；d)将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的可溶性蛋白质。上述蛋白质中，a)的蛋白质名称为α-β2-ε-his，b)的蛋白质名称为α-β2-ε。SEQ ID No.2由937个氨基酸残基组成。上述蛋白质中，蛋白标签是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化等。上述蛋白质中，所述蛋白质可按照包括如下步骤的方法制备：使所述蛋白质的编码基因在生物中进行表达得到所述蛋白质；所述生物为微生物、植物或非人动物。上述蛋白质中，使所述蛋白质的编码基因在生物中进行表达包括将所述的蛋白质的编码基因导入受体微生物，得到表达所述蛋白质的重组微生物，培养所述重组微生物，表达得到所述蛋白质。上述蛋白质中，所述受体微生物可为C1)-C4)中的任一种:C1)原核微生物；C2)革兰氏阴性细菌；C3)埃希氏菌属细菌；C4)大肠杆菌BL21(DE3)。上述蛋白质中，所述蛋白质的编码基因为如下1)或2)或3)所示的基因：1)编码序列是SEQ ID No.1所示的DNA分子(编码α-β2-ε-his)；2)编码序列是SEQ ID No.1的第151-2814位所示的DNA分子(编码α-β2-ε)；3)与1)或2)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述蛋白质的DNA分子。其中，SEQ ID No.1由2820个核苷酸组成，其名称为α-β2-ε-hisY基因，编码氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质α-β2-ε-his。SEQ ID No.1的第151-2814位所示的DNA分子是α-β2-ε-Y基因，编码由SEQ ID No.2第51-937位所示的氨基酸序列组成的蛋白质α-β2-ε。上述蛋白质中，所述重组微生物为将pET30a-α-β2-ε-Y导入大肠杆菌BL21(DE3)得到的表达氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质的重组微生物，所述重组微生物命名为BL21(DE3)/pET30a-α-β2-ε-Y，所述pET30a-α-β2-ε-Y为将载体
pET30a(+)的BamHI和XhoI位点之间的序列替换为SEQ ID No.1第151-2814位(编码α-β2-ε)所示的DNA片段得到的重组载体。上述蛋白质中，所述表达为诱导表达，所述诱导表达是用0.75mM的IPTG在16℃诱导13-16小时或13-24小时或13小时或16小时。D1)或D2)的应用也属于本专利技术的保护范围：D1)所述蛋白质在制备产气荚膜梭菌病诊断抗原中的应用；D2所述蛋白质在制备单克隆抗体中的应用。与所述蛋白质相关的生物材料也属于本专利技术的保护范围，所述生物材料可为下述B1)至B16)中的任一种：B1)编码所述蛋白质的核酸分子；B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；B9)含有B1)所述核酸分子的转基因动物细胞系；B10)含有B2)所述表达盒的转基因动物细胞系；B11)含有B3)所述重组载体的转基因动物细胞系；B12)含有B4)所述重组载体的转基因动物细胞系；B13)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；B14)含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；B15)含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系；B16)含有B4)所述重组载体的转基因植物细胞系。上述生物材料中，所述核酸分子可为如下1)或2)或3)所示的基因：1)编码序列是SEQ ID No.1所示的DNA分子(编码α-β2-ε-his)；2)编码序列是SEQ ID No.1的第151-2814位所示的DNA分子(编码α-β2-ε)；3)与1)或2)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述蛋白质的DNA分子。上述生物材料中，所述重组载体可为所述pET30a-α-β2-ε-Y；所述重组微生物可为E1)或E2)：E1)所述重组微生物为将所述的蛋白质的编码基因导入受体微生物，得到表达所述蛋白质的重组微生物，所述受体微生物为C1)-C4)中的任一种:C1)原核微生物；C2)革兰氏阴性细菌；C3)埃希氏菌属细菌；C本文档来自技高网...
【技术保护点】
a)或b)或c)或d)的蛋白质：a)由SEQ ID No.2的氨基酸序列组成的蛋白质；b)由SEQ ID No.2第51‑937位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；c)在a)或b)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白；d)将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的可溶性蛋白质。
【技术特征摘要】
1.a)或b)或c)或d)的蛋白质：a)由SEQ ID No.2的氨基酸序列组成的蛋白质；b)由SEQ ID No.2第51-937位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；c)在a)或b)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白；d)将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的可溶性蛋白质。2.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于：所述蛋白质按照包括如下步骤的方法制备：使所述蛋白质的编码基因在生物中进行表达得到所述蛋白质；所述生物为微生物、植物或非人动物。3.根据权利要求2所述的蛋白质，其特征在于：使所述蛋白质的编码基因在生物中进行表达包括将权利要求1所述的蛋白质的编码基因导入受体微生物，得到表达权利要求1所述蛋白质的重组微生物，培养所述重组微生物，表达得到权利要求1所述蛋白质。4.根据权利要求3所述的蛋白质，其特征在于：所述受体微生物为C1)-C4)中的任一种:C1)原核微生物；C2)革兰氏阴性细菌；C3)埃希氏菌属细菌；C4)大肠杆菌BL21(DE3)。5.根据权利要求2-4中任一所述的蛋白质，其特征在于：所述蛋白质的编码基因为如下1)或2)或3)所示的基因：1)编码序列是SEQ ID No.1所示的DNA分子；2)编码序列是SEQ ID No.1的第151-2814位所示的DNA分子；3)与1)或2)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。6.根据权利要求3-6中任一所述的蛋白质，其特征在于：所述重组微生物为将pET30a-α-β2-ε-Y导入大肠杆菌BL21(DE3)得到的表达氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质的重组微生物，所述重组微生物命名为BL21(DE3)/pET30a-α-β2-ε-Y，所述pET30a-α-β2-ε-Y为将载体pET30a(+)的BamHI和XhoI位点之间的序列替换为SEQ ID No.1第151-2814位所示的DNA片段得到的重组载体。7.D1)或D2)的应用：D1)权利要求1所述的蛋白质在...
【专利技术属性】
技术研发人员：宋晓晖，孙雨，翟新验，曲萍，
申请(专利权)人：中国动物疫病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：北京;11
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