一种胎盘造血干细胞的制备方法技术

本发明专利技术提供一种胎盘造血干细胞的制备方法，所述制备方法包括胎盘预处理、胎盘血收集、胎盘造血干细胞的提纯，所述制备方法得到的胎盘造血干细胞感染率低，细胞数量多，提取步骤操作简单。

【技术实现步骤摘要】
一种胎盘造血干细胞的制备方法
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种胎盘造血干细胞的制备方法。
技术介绍
造血干细胞，是指具有自我更新和多向分化能力的一类细胞。它的基本特性是具有自我更新能力，即经过一个细胞周期活动之后，可以产生两个与分裂前性质相同的造血干细胞，同时又具有多向分化能力，即在一定的环境条件下，造血干细胞具有向各系血细胞分化的能力，广泛应用于恶性血液病（如急性白血病、慢性粒细胞白血病等）、非恶性难治性血液病（如再生障碍性贫血、骨髓增生异常综合征等）遗传性疾病（先天性免疫缺陷病﹑地中海贫血等）和某些实体瘤治疗。造血干细胞移植是指对病人进行全身照射、化疗和免疫抑制预处理后，将正常供体或自体的造血干细胞经血管输注给病人，使重建正常的造血和免疫功能。随着医学和生物技术的发展，近年来发现胎盘里含有大量的造血干细胞，且所含造血干细胞数量很高，而且移植胎盘造血干细胞的配型要求不需要很严格，移植后反应较轻且不需要采用药物等优点，从胎盘组织提取造血干细胞的方法成为领域内的研究方向。
技术实现思路
本专利技术提供一种从健康产妇足月胎盘中收集造血干细胞的方法。所述方法包括胎盘的预处理、胎盘血收集、胎盘造血干细胞的提纯，步骤分别为：1、胎盘预处理：在无菌环境下，用无菌镊子将胎盘从采集盒中夹出放入事先准备好的无菌铁盒中，且用无菌钳子夹住胎盘表面脐带的一端，去除胎盘表面附着的羊膜、血块，用磷酸盐缓冲液PBS冲洗胎盘表面并浸泡一分钟，缓冲液量应没过整个胎盘，冲洗胎盘次数在2次以上，且每冲洗一次均应另换一个经过灭菌的容器，磷酸盐缓冲液PBS中添加组合抗生素。2、胎盘血收集：清洗完胎盘表面后，用生理盐水和体积分数10%的血液保存液的混合液用一次性注射器自脐带脐动脉进针推入胎盘血管，收集流出的胎盘血液，将收集的血液转移至离心管内。继续用含质量浓度为10g/L的AMD3100的生理盐水灌入胎盘，用脐带夹夹紧脐动脉，孵育30分钟后，收集冲洗液。3、胎盘造血干细胞的提纯：将第一次和第二次收集的胎盘血混合后，按羟乙基淀粉与胎盘血比例为4:1加入羟乙基淀粉混合15分钟，分别分装至离心管进行离心，离心条件为：离心速率为50g/min，升速5档，降速1档，离心时间15min，离心结束后收集上清液，将上清液再次离心，离心条件为：转速2000rpm/min，加速7档，降速4档，离心时间10min，离心结束后收集离心管底部有核细胞。用RPMI1640混合悬浮离心后的细胞，用常规检测方法进行造血干细胞的计数、活性检测；在细胞悬液中加入甲基纤维素培养基中，并振荡至气泡消散，接种于细胞培养板中，放入37℃，5%浓度的二氧化碳培养箱中培养，定期观察细胞集落形成状态。上述步骤1中胎盘预处理的磷酸盐缓冲液PBS的组分为：1000ml灭菌超纯水中加入氯化钠8.5g、磷酸氢二钠2.85g、磷酸二氢钾0.27g、氯化钾0.2g，其中缓冲液中添加抗生素组合青霉素、链霉素混合液（双抗）、庆大霉素、两性霉素B分别添加浓度为3%、2%、1%。本专利技术的有益效果：通过本专利技术所述的胎盘造血干细胞的制备方法得到的胎盘造血干细胞感染率低，细胞数量多，提取步骤操作简单。附图说明图1为流式细胞检测图；图2：胎盘血细胞集落形态40×，其中A为胎盘血形成的红细胞爆式集落，B为胎盘血形成的粒-巨噬细胞集落。具体实施方式为了进一步理解本专利技术，下面结合实施例对本发作进一步说明，但不作为对本专利技术的限定。1、胎盘预处理：在无菌环境下，用无菌镊子将胎盘从采集盒中夹出放入事先准备好的无菌铁盒中，且用无菌钳子夹住胎盘表面脐带的一端，去除胎盘表面附着的羊膜、血块，用磷酸盐缓冲液PBS冲洗胎盘表面并浸泡一分钟，缓冲液量应没过整个胎盘，冲洗胎盘次数在2次以上，且每冲洗一次均应另换一个经过灭菌的容器，磷酸盐缓冲液PBS的组分为：1000ml灭菌超纯水中加入氯化钠8.5g、磷酸氢二钠2.85g、磷酸二氢钾0.27g、氯化钾0.2g，其中缓冲液中添加组合抗生素组合A青霉素、链霉素混合液（双抗），添加浓度为1%，最终得到胎盘血造血干细胞的污染率为5%；添加抗生素组合B青霉素、链霉素混合液（双抗）、庆大霉素分别添加浓度分别为2%和1%，最终得到胎盘血造血干细胞的污染率为3%；添加抗生素组合C青霉素、链霉素混合液（双抗）、庆大霉素、两性霉素B分别添加浓度为3%、2%、1%，每组试验50个胎盘，分离得到胎盘造血干细胞，分别取样采用血培养仪仪器培养，最终得到胎盘血造血干细胞的污染率小于1%。2、胎盘血收集：清洗完胎盘表面后，用100mL生理盐水和市购的体积分数10%的血液保存液Ⅲ的混合液用一次性注射器自脐带脐动脉进针推入胎盘血管，收集流出的胎盘血液，将收集的血液转移至50mL离心管内。继续用含质量浓度为10g/L的AMD3100的生理盐水100毫升灌入胎盘，用脐带夹夹紧脐动脉，孵育30分钟后，收集冲洗液。3、胎盘造血干细胞的提纯：将第一次和第二次收集的胎盘血混合后，按羟乙基淀粉与胎盘血比例为4:1加入羟乙基淀粉混合15分钟，分别分装至50mL离心管，离心条件为：离心速率为50g/min，升速5档，降速1档，离心时间15min，离心结束后收集上清液，将上清液再次离心，离心条件为：转速2000rpm/min，加速7档，降速4档，离心时间10min，离心结束后收集离心管底部有核细胞。4、胎盘造血干细胞的检测：用RPMI1640混合悬浮离心后的细胞，用常规检测方法进行造血干细胞的计数、活性检测，胎盘造血干细胞有核细胞数和CD34+细胞数如表一，流式细胞仪检测CD34+细胞数量如图1所示，CD34+阳性细胞的比率可达到1%-2%。表一：样本编号样本体积（ml）有核细胞数CD34+细胞数11502.1×1092.3×10721451.5×1091.65×10731221.4×1091.5×1075、细胞集落培养：取0.9毫升5×104的细胞悬液，加入甲基纤维素培养基中，并振荡至气泡消散，接种于细胞培养板中，放入37℃，5%浓度的二氧化碳培养箱中培养，定期观察，细胞接种第14天可观察到细胞集落形成良好，如图2所示。胎盘造血干细胞细胞集落形成数目如表二。表二：样本编号红细胞爆式集落粒-巨噬细胞集落155652426433260本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种胎盘造血干细胞的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括胎盘预处理、胎盘血收集、胎盘造血干细胞的提纯，步骤为：1）、胎盘预处理：在无菌环境下，用无菌镊子将胎盘从采集盒中夹出放入事先准备好的无菌铁盒中，且用无菌钳子夹住胎盘表面脐带的一端，去除胎盘表面附着的羊膜、血块，用磷酸盐缓冲液PBS冲洗胎盘表面并浸泡一分钟，缓冲液量应没过整个胎盘，冲洗胎盘次数在2次以上，且每冲洗一次均应另换一个经过灭菌的容器，磷酸盐缓冲液PBS中添加组合抗生素；2）、胎盘血收集：清洗完胎盘表面后，用生理盐水和体积分数10%的血液保存液的混合液用一次性注射器自脐带脐动脉进针推入胎盘血管，收集流出的胎盘血液，将收集的血液转移至离心管内；继续用含质量浓度为10g/L的AMD3100的生理盐水灌入胎盘，用脐带夹夹紧脐动脉，孵育30分钟后，收集冲洗液；3）、胎盘造血干细胞的提纯：将第一次和第二次收集的胎盘血混合后，按羟乙基淀粉与胎盘血比例为4:1加入羟乙基淀粉混合15分钟，分别分装至离心管进行离心，离心条件为：离心速率为50g/min，升速5档，降速1档，离心时间15min，离心结束后收集上清液，将上清液再次离心，离心条件为：转速2000rpm/min，加速7档，降速4档，离心时间10min，离心结束后收集离心管底部有核细胞；用RPMI1640混合悬浮离心后的细胞，用常规检测方法进行造血干细胞的计数、活性检测；在细胞悬液中加入甲基纤维素培养基中，并振荡至气泡消散，接种于细胞培养板中，放入37℃，5%浓度的二氧化碳培养箱中培养，定期观察细胞集落形成状态。...

【技术特征摘要】
1.一种胎盘造血干细胞的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括胎盘预处理、胎盘血收集、胎盘造血干细胞的提纯，步骤为：1）、胎盘预处理：在无菌环境下，用无菌镊子将胎盘从采集盒中夹出放入事先准备好的无菌铁盒中，且用无菌钳子夹住胎盘表面脐带的一端，去除胎盘表面附着的羊膜、血块，用磷酸盐缓冲液PBS冲洗胎盘表面并浸泡一分钟，缓冲液量应没过整个胎盘，冲洗胎盘次数在2次以上，且每冲洗一次均应另换一个经过灭菌的容器，磷酸盐缓冲液PBS中添加组合抗生素；2）、胎盘血收集：清洗完胎盘表面后，用生理盐水和体积分数10%的血液保存液的混合液用一次性注射器自脐带脐动脉进针推入胎盘血管，收集流出的胎盘血液，将收集的血液转移至离心管内；继续用含质量浓度为10g/L的AMD3100的生理盐水灌入胎盘，用脐带夹夹紧脐动脉，孵育30分钟后，收集冲洗液；3）、胎盘造血干细胞的提纯：将第一次和第二次收集的胎盘血混合后，按羟乙基淀粉与胎盘血比例为4:1加入...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐鹏，章晟，
申请(专利权)人：福建泽源生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：福建,35