本发明专利技术涉及一种利用淀粉样蛋白Aβ25‑35制备人视网膜上皮细胞(ARPE)毒性模型的方法及应用，包括将Aβ25‑35用细胞培养基制备成寡聚体；接种细胞并培养；按照Aβ25‑35寡聚体不同浓度处理ARPE细胞；MTT方法检测细胞数目。该发明专利技术方法利用Aβ蛋白对ARPE细胞的毒性，建立细胞毒性模型，可应用于体外精准靶向研究Aβ蛋白对年龄相关性黄斑变性(AMD)的影响，为分析和揭示年龄相关性黄斑变性(AMD)发生的诱发因素及其分子调控机理提供可行有效的研究工具。
【技术实现步骤摘要】
利用淀粉样蛋白Aβ25-35制备人视网膜上皮细胞(ARPE)毒性模型的方法及应用
本专利技术涉及细胞学领域，具体涉及一种利用淀粉样蛋白Aβ25-35制备人视网膜上皮细胞(ARPE)毒性模型的方法及应用。
技术介绍
年龄相关性黄斑变性(age-relatedmaculardegeneration,AMD)是老年人中最常见的导致视力下降甚至丧失的原因之一。随着人口老龄化的增长，发病率呈逐年上升趋势，因AMD致盲的人数占到全球盲人总数的8.7％。严重影响人们的生活质量和生存安全。AMD最主要的形态学特征是玻璃膜疣，即RPE细胞的异常代谢产物的过度沉积。玻璃膜疣的成分非常复杂及丰富，其中含有多种与炎症反应及氧化应激反应相关的脂质及蛋白质类物质、免疫相关蛋白、玻连蛋白、淀粉样蛋白、补体调节分子等。目前AMD的发病机制仍不清楚。多数学者认为AMD是多因素疾病，除了年龄与之有极强的相关性，代谢、功能、基因和环境等因素也均可影响其发病。近年来很多研究应用免疫组化和分子生物学方法研究AMD的发病，结果均表明炎性过程的局部活化，可以导致活化的补体成分、急性期反应物、免疫调节物和其它炎性因子的聚集把那个参与AMD发生的过程。流行病学相关报道Aβ和阿尔茨海默病(AD)、AMD都具有一定关联：眼睛和大脑的发育最初均来源于同一个胚胎胚层，并且AD和AMD具有相同形态表型和免疫生成病因，他们有一个共同的Aβ蛋白起作用的过程。Aβ是参与神经损伤及致细胞凋亡的非常重要的因子，它是淀粉样前体蛋白(amyloidprecursorprotein,APP)的降解产物。在以往的研究中发现，Aβ1-42具有细胞毒性可导致细胞凋亡，并且对RPE细胞的正常生长有着一定的损伤作用，说明Aβ在视网膜上的积累会对视网膜细胞的活性造成影响，从而影响视网膜的正常功能。但是，在制备Aβ1-42对RPE细胞的毒性模型中，Aβ1-42寡聚体制备过程繁琐，且容易导致制备后无活性，所以寻求更简便、更高效的Aβ诱导的ARPE细胞毒性模型可为深入探索Aβ蛋白对年龄相关性黄斑变性(AMD)的影响、年龄相关性黄斑变性(AMD)发生的诱发因素及其分子调控机理等方面的研究提供可行有效的工具。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种利用淀粉样蛋白Aβ25-35制备人视网膜上皮细胞(ARPE)毒性模型的方法，该专利技术方法解决了以往Aβ1-42寡聚体制备过程繁琐，且容易导致制备后无活性而无法获得Aβ1-42诱导的ARPE细胞毒性模型的问题。可应用于体外精准靶向研究Aβ蛋白对年龄相关性黄斑变性(AMD)的影响，为分析和揭示年龄相关性黄斑变性(AMD)发生的诱发因素及其分子调控机理提供可行有效的研究工具。本专利技术所述方法包括以下步骤：a、将淀粉样蛋白Aβ25-35用细胞培养基制备成寡聚体；b、接种ARPE细胞并培养；c、按照Aβ25-35寡聚体不同浓度处理ARPE细胞；d、在Aβ25-35寡聚体处理48-60h后，按照常规的MTT方法进行检测，筛选淀粉样蛋白Aβ25-35对ARPE细胞毒性的最优浓度条件。进一步的，步骤a中包括：a1：于无菌条件下将Aβ25-35蛋白按照1mg加0.36ml溶剂的比例溶解，配成浓度为1mmol/L-10mmol/L的Aβ25-35储存液；a2：将Aβ25-35储存液置于二氧化碳培养箱中35℃-39℃孵育，使其老化以获得Aβ寡聚体；每天1次将Aβ25-35储存液颠倒混匀；3-7天后将Aβ25-35储存液从二氧化碳培养箱中取出，保存于4℃或者直接使用。进一步的，步骤b中包括：b1：取处于增殖期的APRE细胞，用PRMI1640完全培养基配成单细胞悬液，接种到96孔细胞培养板，调整细胞最终接种密度为10％-20％，每孔体积100μl。进一步的，步骤c中包括：c1：待接种细胞完全贴壁后，弃去培养基，加入含有不同浓度Aβ25-35储存液(0μmol/L，0.3μmol/L，1.0μmol/L，5.0μmol/L，20μmol/L，60μmol/L)的PRMI1640完全培养基；每2d换液1次。进一步的，步骤a1中的溶剂采用PRMI1640培养基或无菌超纯水。进一步的，步骤a1中Aβ25-35储存液的浓度为2.5mmol/L。进一步的，步骤a2中孵育温度为37℃，5天后将Aβ25-35储存液从二氧化碳培养箱中取出。进一步的，步骤b1中，所述细胞最终接种密度为15％。进一步的，步骤d中，淀粉样蛋白Aβ25-35对ARPE细胞毒性的最优浓度条件为60μmol/L。上述的方法获得的细胞毒性模型在针对体外研究Aβ蛋白对年龄相关性黄斑变性(AMD)的影响、年龄相关性黄斑变性(AMD)发生的诱发因素及其分子调控机理中的应用。本专利技术的有益效果是：本方法使用常规的技术和试剂，利用现有试剂材料制备Aβ诱导的ARPE细胞的方法，实现了制备这一研究工具的技术改进。本方法制备的Aβ25-35寡聚体诱导的ARPE细胞毒性模型，可应用于体外精准靶向研究Aβ蛋白对年龄相关性黄斑变性(AMD)的影响，为分析和揭示年龄相关性黄斑变性(AMD)发生的诱发因素及其分子调控机理提供可行有效的研究工具。较之以前的研究，本方法的技术操作简便、易于掌握、无额外的毒性潜在危险等优点。附图说明图1为实施例1不同浓度Aβ25-35寡聚体诱导ARPE细胞制备毒性模型的细胞活性效应检测图。不同的Aβ25-35寡聚体浓度(0μmol/L，0.3μmol/L，1.0μmol/L，5.0μmol/L，20μmol/L，60μmol/L)处理48h后，MTT检测细胞数目。Means±SD，n＝8。图2为实施例2制备的Aβ25-35寡聚体诱导的ARPE细胞毒性模型的细胞周期关键基因CCNE表达检测图。60μmol/LAβ25-35寡聚体处理ARPE细胞48h后，收集对照组和模型组细胞进行Q-PCR检测。发现模型组细胞中调控G1/S期转化的关键基因CCNEmRNA表达水平显著上调(P<0.01)。Means±SD，n＝3。图3为实施例3制备的Aβ25-35寡聚体诱导的ARPE细胞毒性模型的细胞凋亡关键蛋白CASP3活性检测图。60μmol/LAβ25-35寡聚体处理ARPE细胞48h后，收集对照组和模型组细胞进行westernblotting检测。发现模型组细胞中调控细胞凋亡的关键蛋白CASP3的活性明显上调。具体实施方式本专利技术所述方法包括五个大步骤a、将淀粉样蛋白Aβ25-35用细胞培养基制备成寡聚体；b、接种ARPE细胞并培养；c、按照Aβ25-35寡聚体不同浓度处理ARPE细胞；d、在Aβ25-35寡聚体处理48-60h后，按照常规的MTT方法进行检测，筛选淀粉样蛋白Aβ25-35对ARPE细胞毒性的最优浓度条件。下面对上述五个大步骤分步做详细的说明：a1：于超净工作台中无菌条件下将Aβ25-35蛋白(Sigma，货号A4559，1mg规格)按照1mg加0.36mlPRMI1640培养基或无菌超纯水的比例溶解，配成浓度为2.5mmol/L的Aβ25-35储存液。溶解Aβ25-35蛋白的溶剂选用PRMI1640培养基或无菌超纯水，优选的选用PRMI1640培养基。后面步骤中ARPE细胞培养时使用PRMI1640培养基，因此选用本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用淀粉样蛋白Aβ25‑35制备人视网膜上皮细胞(ARPE)毒性模型的方法，包括以下步骤：a、将淀粉样蛋白Aβ25‑35用细胞培养基制备成寡聚体；b、接种ARPE细胞并培养；c、按照Aβ25‑35寡聚体不同浓度处理ARPE细胞；d、在Aβ25‑35寡聚体处理ARPE细胞48‑60h后，按照常规的MTT方法进行检测，筛选Aβ25‑35寡聚体对ARPE细胞毒性的最优浓度条件。
【技术特征摘要】
1.一种利用淀粉样蛋白Aβ25-35制备人视网膜上皮细胞(ARPE)毒性模型的方法，包括以下步骤：a、将淀粉样蛋白Aβ25-35用细胞培养基制备成寡聚体；b、接种ARPE细胞并培养；c、按照Aβ25-35寡聚体不同浓度处理ARPE细胞；d、在Aβ25-35寡聚体处理ARPE细胞48-60h后，按照常规的MTT方法进行检测，筛选Aβ25-35寡聚体对ARPE细胞毒性的最优浓度条件。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a中包括：a1：于无菌条件下将Aβ25-35蛋白按照1mg加0.36ml溶剂的比例溶解，配成浓度为1mmol/L-10mmol/L的Aβ25-35储存液；a2：将Aβ25-35储存液置于二氧化碳培养箱中35℃-39℃孵育，使其老化以获得Aβ寡聚体；每天1次将Aβ25-35储存液颠倒混匀；3-7天后将Aβ25-35储存液从二氧化碳培养箱中取出，保存于4℃或者直接使用。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤b中包括：b1：取处于增殖期的APRE细胞，用PRMI1640完全培养基配成单细胞悬液，接种到96孔细胞培养板，调整细胞最终接种密度为10％-20％，每孔体积100μ...
【专利技术属性】
技术研发人员：叶子，李朝辉，
申请(专利权)人：中国人民解放军总医院，
类型：发明
国别省市：北京,11
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