一种原代培养背根神经节卫星胶质细胞的方法技术

本发明专利技术公开了一种原代培养背根神经节卫星胶质细胞的方法，所述方法操作如下：步骤(1)将新生小鼠或大鼠消毒后断头处死，解剖后取出脊柱，剔除脊柱上肌肉，剪开脊柱，在体视显微镜下清理血管和脊髓并取出DRG，剔除DRG上的神经纤维和被膜；步骤(2)将处理好的DRG采用DRG‑SGCs培养液培养，诱导大量的卫星胶质细胞从DRG中迁出，培养结束后加入胰蛋白酶消化，然后加入FBS终止消化，采用巴氏吹吸管轻轻吹打后，转移至离心管中进行离心；步骤(3)离心后弃上清液，然后加入培养液继续培养，得到卫星胶质细胞。本发明专利技术培养和纯化的卫星胶质细胞体外可存活较长时间，纯度高，稳定存活，可传代多代，形成细胞网络。

Method for primary culture of satellite glial cell of dorsal root ganglion

The invention discloses a method for primary culture of dorsal root ganglion satellite glial cells, the operation of the method includes the following steps: (1) newborn mice or rats were decapitated after disinfection, removed after spinal muscle anatomy, remove the spine, cut the spine and spinal cord, clean blood vessels under the stereomicroscope and remove DRG DRG, excluding nerve fibers and film; step (2) will deal with DRG DRG SGCs cultured, induced by the large number of satellite glial cell migration from the DRG, after the cultivation with trypsin digestion, then add FBS to terminate the digestion, the Pap Straw blowing gently pipetting and transferred to centrifuge centrifugal tube; step (3) after centrifugation, the supernatant was removed, and then added into the culture medium and cultured by satellite glial cells. The cultured and purified satellite glial cells of the invention can survive in vitro for a long time, have high purity, stable survival, and can be passaged for generations to form a cell network.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于背根节卫星胶质细胞分离培养
，尤其涉及一种体外原代培养背根神经节卫星胶质细胞的方法。
技术介绍
背根神经节(dorsalrootganglion，DRG)的神经细胞是躯体感觉的初级传入神经元，其中枢突进入脊髓发出上行纤维，与其它部位的神经元再次形成突触连接，如和丘脑的神经元形成脊髓丘脑束等。这些神经元和上行纤维在感觉从外周到中枢的传递过程中起着重要的作用。卫星胶质细胞(satelliteglialcels，SGCs)是外周神经中一种重要的神经胶质细胞，它们广泛地分布于背根神经节(dorsalrootganglia，DRG)和三叉神经节(trigeminalganglia，TG)内.卫星胶质细胞包绕1-2个神经元形成胶质细胞鞘，在两个相邻的卫星胶质细胞之间存在着缝隙连接，通过缝隙连接可以实现胶质细胞之间的交流。DRG-SGC的培养为研究神经系统发育过程中突起的生长发育机制和影响因素、神经元如何形成特殊的突触联系、如何构成极其复杂的神经网络以执行各种生理功能等这些问题提供了良好的模型。因此，建立一种稳定的、高效的、高纯度的DRG-SGCs体外原代培养模型具有重要意义。目前国内研究多集中于从DRG中体外分离培养神经元，常用的方法是取大鼠脊髓背根神经节，用酶消化后制成单细胞悬液，建立体外背根神经节单细胞培养体系。例如禹晓东等人在“大鼠脊髓背根神经节神经元的纯化培养”一文中取新生SD大鼠的脊髓背根神经节，采用胰蛋白酶消化法，制成单细胞悬液，加入阿糖胞苷以纯化细胞，培养于含10％胎牛血清与重组人胶质细胞源性神经营养因子的DF12培养基中，观察神经元生长状况。李全波等人在“大鼠背根神经节神经元细胞纯化培养的模型建立”以及谭洪毅等人在“体外获得高纯度大鼠背根神经节神经元的原代培养”中通过胰蛋白酶+EDTA消化DRG、交替使用DF-12培养基和加有阿糖胞苷抗有丝分裂的DF-12培养基培养等方法，在体外获得纯化的背根神经节神经元。张军等人在“胚胎大鼠背根神经节神经元的培养与纯化”，以及隋峰等人在“一种原代培养大鼠DRG神经元的新方法”中把DRG置于0.25％胰蛋白酶液中消化20min(37摄氏度)，加入胎牛血清(FBS)终止消化，然后在DMEM中制成单细胞悬液，经差速贴壁50min去除成纤维细胞，获得大鼠背根神经节单细胞培养体。上述方法只能从DRG中体外分离培养神经元，但未能分离培养卫星胶质细胞。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供一种原代培养背根神经节卫星胶质细胞的方法，所述方法采用鼠的DRG组织，不需要经过消化过程，直接培养卫星胶质细胞，操作简单，可获得大量高度纯化和稳定的背根节卫星胶质细胞，可作为发育神经生物学、神经生物学和临床神经病学等研究的重要模型。本专利技术的技术方案如下：一种原代培养背根神经节卫星胶质细胞的方法，所述方法操作如下：步骤(1)将新生小鼠或大鼠消毒后断头处死，解剖后取出脊柱，剔除脊柱上肌肉，剪开脊柱，在体视显微镜下清理血管和脊髓并取出DRG，剔除DRG上的神经纤维和被膜；步骤(2)将处理好的DRG采用DRG-SGCs培养液培养，诱导大量的卫星胶质细胞从DRG中迁出，培养结束后进行细胞传代，加入胰蛋白酶消化，然后加入FBS终止消化，采用巴氏吹吸管轻轻吹打后，转移至离心管中进行离心；步骤(3)离心后弃上清液，然后加入DRG-SGCs培养液继续培养，得到卫星胶质细胞；所述DRG-SGCs培养液成分包括DMEM/F12、B27、青霉素-链霉素双抗、L-谷氨酰胺、BSA(牛血清白蛋白)、NRG1-β1(神经调节蛋白)、地塞米松、Insulin(胰岛素)、T3(三碘甲状腺氨酸钠)和T4(四碘甲状腺原氨酸)。获得高纯度的卫星胶质细胞培养体系有利于特定细胞的生物学特点和细胞功能的研究。背根神经节包含丰富的神经元以及卫星胶质细胞、雪旺细胞和成纤维细胞，如何获得丰富的卫星胶质细胞依然是背根神经节分离培养的难点之一。为了获得更纯净和更均匀的卫星胶质细胞，首先解剖时，分离出背根神经节后要完全剥离表面的包膜和周围的神经丝，这不仅有效去除成纤维细胞和雪旺细胞，并且还有利于背根神经节的生长。其次培养时，在培养基中添加L-谷氨酰胺,L-谷氨酰胺不仅可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢，并且可以抑制其它细胞如神经元的生长。L-谷氨酰胺使成熟的神经元由于兴奋性中毒死亡，而对胶质细胞起着促进生长的作用。无血清培养基和B27添加剂结合抑制成纤维细胞和雪旺细胞的分裂增殖并且选择性的促进的卫星胶质细胞的存活，青链霉素防止培养过程中的细菌和真菌污染，人重组神经调节蛋白是一种细胞间信号转导蛋白,在脑组织内由神经胶质细胞和神经元产生，它能促进胶质细胞存活、迁移、增殖。地塞米松、三碘甲状腺原氨酸、L-甲状腺素作为激素共同调节卫星胶质细胞的生长和增值，采用上述解剖方法和培养液，卫星胶质细胞的纯化率可达到95％以上。作为优选，每50mLDRG-SGCs培养液中DMEM/F12含量为46～48mL，B27含量为0.8～1.2mL，青霉素-链霉素双抗含量为0.4～0.6mg，L-谷氨酰胺含量为0.4～0.6mg，BSA含量为15mg～20mg，NRG1-β1含量为1～1.2ug，地塞米松含量为1.8～2ug，Insulin含量为280～300ug，T3含量为0.5～0.6ug，T4含量为20～24ug。作为优选，所述新生小鼠或新生大鼠为出生0～24小时的乳鼠。目前用于背根神经节培养的动物包括鸡，猫和成年鼠，而人类的背根神经节由于医学伦理和有限资源很少使用。对于大鼠脊髓背根神经节的培养多采用孕14-20天胚胎大鼠，胚胎时期的背根节属于较幼稚的阶段，较成年大鼠易于成活，但也存在获得细胞数量少，不易剥离神经节表面筋膜、导致成纤维细胞等杂质细胞多的缺点。在本专利技术中优选新生24小时内的乳鼠，背根节较胎鼠成熟，易于剥离表明的被膜，使得所需细胞的纯度更高，且背根节还处于幼稚阶段，也易获得细胞。在分离背根神经节的过程中，当清理脊柱内的脊髓和血管时要注意动作轻柔且快，全程冰上操作。由于它们位于深处并且体积很小，分离有一些困难，而背根神经节的采样时间是成功培养卫星胶质细胞的关键影响因素，只有减少采样时间才可以保证培养细胞的活性。本专利技术快速取出DRG的具体方法：首先用眼科剪沿新生/胚胎大鼠的背部正中线剪开皮肤(从尾椎至颈椎),用游丝镊子小心向两侧分离皮肤,暴露椎骨,此时椎管轮廓清晰可见。然后将新生/胚胎鼠移至体视显微镜下,用眼科剪沿椎管走向从尾椎至颈椎剪开椎骨,使脊髓充分暴露。然后用游丝镊子轻轻将脊髓取出,清理剩余的脊膜组织,此时可见圆形或椭圆形神经节完全暴露。于体视显微镜下用游丝镊子从椎间孔内将神经节逐个取出。进一步地，步骤(2)将处理好的DRG接种在六孔培养板中，培养板内有DRG-SGCs培养液，每个孔接种8～11个背根节，然后在36～38℃，5％CO2培养箱中培养。进一步地，步骤(2)将处理好的DRG在培养过程中随着DRG迁出的SGCs占据培养板底部85％以上时停止培养。进一步地，步骤(2)将将处理好的DRG采用DRG-SGCs培养液连续培养一次后，再转移至新的DRG-SGCs培养液中，再次诱导卫星胶质细胞从DR本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种原代培养背根神经节卫星胶质细胞的方法，其特征在于，所述方法操作如下：步骤(1)将新生小鼠或大鼠消毒后断头处死，解剖后取出脊柱，剔除脊柱上肌肉，剪开脊柱，在体视显微镜下清理血管和脊髓并取出DRG，剔除DRG上的神经纤维和被膜；步骤(2)将处理好的DRG采用DRG‑SGCs培养液培养，诱导卫星胶质细胞从DRG中迁出，培养结束后进行细胞传代，加入胰蛋白酶消化，然后加入FBS终止消化，采用巴氏吹吸管轻轻吹打后，转移至离心管中进行离心；步骤(3)离心后弃上清液，然后加入DRG‑SGCs培养液接种在多聚赖氨酸包被过的六孔板继续培养，得到卫星胶质细胞；所述DRG‑SGCs培养液成分包括DMEM/F12、B27、青霉素‑链霉素双抗、L‑谷氨酰胺、BSA(牛血清白蛋白)、NRG1‑β1(神经调节蛋白)、地塞米松、Insulin(胰岛素)、T3(三碘甲状腺氨酸钠)和T4(四碘甲状腺原氨酸)。

【技术特征摘要】
1.一种原代培养背根神经节卫星胶质细胞的方法，其特征在于，所述方法操作如下：步骤(1)将新生小鼠或大鼠消毒后断头处死，解剖后取出脊柱，剔除脊柱上肌肉，剪开脊柱，在体视显微镜下清理血管和脊髓并取出DRG，剔除DRG上的神经纤维和被膜；步骤(2)将处理好的DRG采用DRG-SGCs培养液培养，诱导卫星胶质细胞从DRG中迁出，培养结束后进行细胞传代，加入胰蛋白酶消化，然后加入FBS终止消化，采用巴氏吹吸管轻轻吹打后，转移至离心管中进行离心；步骤(3)离心后弃上清液，然后加入DRG-SGCs培养液接种在多聚赖氨酸包被过的六孔板继续培养，得到卫星胶质细胞；所述DRG-SGCs培养液成分包括DMEM/F12、B27、青霉素-链霉素双抗、L-谷氨酰胺、BSA(牛血清白蛋白)、NRG1-β1(神经调节蛋白)、地塞米松、Insulin(胰岛素)、T3(三碘甲状腺氨酸钠)和T4(四碘甲状腺原氨酸)。2.如权利要求1所述的原代培养背根神经节卫星胶质细胞的方法，其特征在于，每50mLDRG-SGCs培养液中DMEM/F12含量为46～48mL，B27含量为0.8～1.2mL，青霉素-链霉素双抗含量为0.4～0.6mg，L-谷氨酰胺含量为0.4～0.6mg，BSA含量为15mg～20mg，NRG1-β1含量为1～1.2ug，地塞米松含量为1.8～2ug，Insulin含量为28...

【专利技术属性】
技术研发人员：李力燕，郭建辉，马薇，杨金伟，王先斌，李兴统，王通通，代云飞，张泰，李永进，
申请(专利权)人：昆明医科大学，
类型：发明
国别省市：云南;53