本发明专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种用于治疗帕金森综合症的缺失型重组人中脑星形胶质细胞源性神经营养因子。通过对人中脑星形胶质细胞源性神经营养因子进行N端部分缺失突变，得到的缺失型重组人中脑星形胶质细胞源性神经营养因子具有活性更高的特点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程药物生产领域。通过对人中脑星形胶质细胞源性神经营养因 子进行N末端的缺失，得到了缺失型重组人中脑星形胶质细胞源性神经营养因子。实验证 明，通过与全长人中脑星形胶质细胞源性神经营养因子进行比较，该结构具有更高的比活 性，有望被开发成为治疗帕金森综合症的一种产品。 二、
技术介绍
帕金森病（Parkinson disease，PD)是一种常见的神经系统病变性疾病，其确切 的病因学机制至今未明，目前普遍认为系遗传与环境因素共同作用的结果。其中氧化（硝 化）应激、小胶质细胞活化与神经炎症、线粒体功能障碍、蛋白质的聚集与清除障碍、自噬 应激等事件是其病理生理学机制中的关键环节。目前研究的结果，正常人黑质致密部中大 约有50万个特化的多巴胺能神经细胞，当其被破坏75-80%时，患者将出现帕金森病的症 状。遗传学方面，目前已发现13个基因连锁位点与家族性的发病相关。除线粒体DNA突 变外，Parkin、PINK1、DJ-1等基因突变与常染色体隐性遗传的家族性有关，而突触核蛋 白、UCH-L1、LRRK2等基因与常染色体显性遗传的家族性有关，其中PINK1、Parkin、DJ-1 属线粒体蛋白，与线粒体功能密切相关。 帕金森疾病的临床表现为震颤、强直、姿势不稳和无法或者迟缓运动，我国ro患 者已经达到约300万人，目前ro的治疗主要以药物为主，包括抗胆碱能药、金刚烷胺、左旋 多巴及复方左旋多巴，这些药物可暂时改善症状，但不能阻止病情发展。 目前针对帕金森综合症，人们重点的研究重点在脑神经细胞保护方面，现在主要 集中在神经营养因子上。神经营养因子是一类小分子分泌蛋白，通过与相应的受体结合，调 节神经细胞的生长、发育、成熟与存活，尤其在调控神经元的数量、突起的分支、突触的形成 和神经细胞表型的成熟等发面发挥重要作用。神经营养因子还有促进损伤后神经元再生， 治疗慢性神经系统疾病的功能。其中中脑星形胶质细胞源性神经营养因子（mesencephalic astrocyte derived neurotrophic factor，MANF)是目前人们研究的重点，MANF是Petrova 等于2003年首次在体外传代培养的大鼠中脑I型星形胶质细胞的培养基中分离到的一种 能促进体外多巴胺神经元存活的神经营养因子，分子量为18kD。MANF具有促进多巴胺神经 元存活的作用，研究发现MANF基因缺失的果蝇会因多巴胺能神经元数量和多巴胺水平的 减少而死亡，给予人源性MANF可发挥替代功能。在大鼠中风模型中，MANF可保护大脑皮层 神经元，在6-羟基多巴胺（6-hydroxydopamine，6-〇HDA)诱导的大鼠帕金森模型中，通过纹 状体内注射MANF不但能保护中脑多巴胺神经元和纹状体多巴胺神经纤维，而且能加强存 活神经元的功能、修复受损的黑质-纹状体多巴胺系统，减少帕金森大鼠的运动障碍，具有 预防和治疗的双重潜在作用。同时，研究还证明与目前广泛研究的胶质细胞源性神经营养 因子（GDNF)相比，MANF对细胞外基质亲和力低，扩散范围较大；选择性作用于多巴胺神经 元，对周围运动、感觉神经元和交感神经元无影响，副作用小；在低、中药物浓度时的选择性 较⑶NF高。因此，MANF作为一种强效神经保护因子，被认为是治疗某些中枢神经系统疾病 的潜在候选因子，对于帕金森综合症的治疗有较大的应用前景。本专利技术对天然人MANF进行 了缺失突变，得到的突变体具有活性更高的特点。 三、
技术实现思路
本专利技术涉及缺失型人MANF的制备。 全长人MANF由179个氨基酸组成，成熟的人MANF切去了 N末端的21个氨基酸， 是由158个氨基酸组成的分子量约为17kD，研究表明，分子结构主要是由2个α螺旋组成 的功能区，Ν末端1-3位氨基酸处于无规卷曲形态，不是功能所必须的，而且暴露在溶液外， 推测对分子在溶液中的稳定性具有不利的影响。据此，本专利技术将MANF的Ν末端3个氨基酸 去除，得到了缺失型MANF (dMANF)。 经测试，本专利技术的缺失型MANF的生物学活性明显高于天然型人MANF，具有潜在的 治疗帕金森综合症的作用。 四、【具体实施方式】 以下实例仅是对本专利技术的说明，而不会对本专利技术产生任何限制。(一）质粒构建和工程菌获得 1.天然人MANF和dMANF表达质粒构建 分别按照Seq ID Nol和Seq ID No2氨基酸序列，采用大肠杆菌喜好的密码子，化 学合成天然人MANF和缺失型MANF的基因序列。 采用PGEX-4T-1载体作为MANF的表达载体，其含有GST伴侣蛋白序列，能够 有效地增强目的蛋白的表达，并且利于目的蛋白的下游纯化。采用BamHI-Sall双酶切 PGEX-4T-1载体，并回收大片段，T4连接酶将目的基因和载体大片段连接后，转化至克隆菌 株JM109中，再对经筛选的单克隆重组质粒进行目的基因测序，目的基因测序结果与理论 序列一致，完成PGEX-4T-1-MANF和pGEX-4T-1-dMANF的重组表达载体的构建。 2.转化和工程菌构建 用CaCl2法转化大肠杆菌BL21，涂布在含有50ug/ml氨苄青霉素的LB平板，挑选 阳性菌落在LK中培养至0D6。。为0. 6-0. 8时加入IPTG 0.1 mM诱导3-4小时离心收集菌体， 8M尿素破菌后15% SDS-PAGE电泳时出现一条约18kD左右的蛋白带，表达量约为30%。获 得工程菌株 PGEX-4T-1-MANF/BL21 和 pGEX-4T-1-dMANF/BL21。 (二）目的蛋白获得 1.发酵 1)培养基： ⑴种子液培养基（LK): 胰蛋白胨：1〇克/升、酵母粉：5克/升、氯化钠：10克/升、卡那霉素：50微克/ 毫升。 (2)上罐培养基（15升）： 磷酸氢二钠：315克、磷酸二氢钾：100克、氯化钠：10. 05克、氯化铵：50克、胰蛋白 胨：90克。 以上成分一起在罐中灭菌；下面的成分单独灭菌后加入发酵罐。 硫酸镁：15克、葡萄糖：450克、补料（500克/升）：葡萄糖。 2)发酵过程： (1)种子培养： 从已鉴定的平皿上划取菌种，接种到50毫升（250毫升的三角瓶）LC中，36度、200 转/分、8小时后将这50毫升种子液转接到700毫升LC中，36度、200转/分，过夜。 (2)发酵过程： 将培养好的种子液（0D600 = 3-4)加入罐中，调好各参数，36度、150转、溶氧 100%，开始发酵；5小时后开始以2. 5mL/min的速度流加2小时，约加入800毫升补料，加 入1克IPTG诱导（4小时）。 3)收集菌体 离心6000rpm，15min，收集菌体，冷冻保存。 2.纯化 1)亲和层析 采用GSH-Agrose层析介质（Sigma公司），平衡液采用25mM Tris-HCl，pH8,上样 平衡后，裂菌的离心上清上Glutathione Sepharose层析柱，平衡后用含10mM还原型谷胱 甘肽（GSH)的洗脱液洗下融合蛋白。 2)酶解 上一步的洗脱液加入凝血酶（5NIHU/mL) 37°C酶切2小时。 3)阴离子交换层析 采用Q Sepharose HP层析介质，平衡液为25mM Tris-HCl，pH8,上一步得本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种缺失型重组人中脑星形胶质细胞源性神经营养因子，由155个氨基酸组成，其氨基酸序列见SEQ ID No2。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘爱华，王辉，莘旭妮，
申请(专利权)人：北京泳健生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
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