人源iPS干细胞体外定向分化为神经细胞的试剂盒及方法技术

本发明专利技术提供了一种人源iPS干细胞体外定向分化为神经细胞的试剂盒及方法，利用本发明专利技术试剂盒所提供的培养液以及按照本发明专利技术方法可以使iPS干细胞高效地、定向地分化为神经细胞。本发明专利技术的试剂盒和方法简单可靠，稳定高效，安全性高，多能干细胞向神经细胞分化的比例明显提高，其分化比例大于90％。同时，本发明专利技术的试剂盒和培养基适用于大规模生产高品质的神经细胞，无需后续的筛选和纯化步骤，可以直接用于神经发育科学研究，神经疾病的细胞治疗，神经损伤的修复以及药物筛选的应用需求。

Kit and method for in vitro differentiation of human iPS stem cells into nerve cells

The invention provides a human iPS stem cells differentiation into neural cells kit and method, medium provided by the kit, according to the method of the invention can make iPS cells efficiently, directed differentiation into neural cells. The kit and the method of the invention are simple, reliable, stable, efficient and safe, and the proportion of multipotent stem cells to nerve cells is obviously improved, and the differentiation ratio is greater than 90%. At the same time, the kit of the invention and a culture medium suitable for the large-scale production of high-quality nerve cells, without the need for subsequent screening and purification steps, can be directly used in scientific research and development of nerve cells for the treatment of neurological diseases, the repair of nerve injury and the application demand for drug screening.

【技术实现步骤摘要】
人源iPS干细胞体外定向分化为神经细胞的试剂盒及方法
本专利技术涉及干细胞生物学与再生医学领域，具体地涉及一种人源iPS干细胞体外定向分化为神经细胞的试剂盒及方法。
技术介绍
诱导性多能干细胞(inducedpluripotentstemcells,iPSCs)是由日本Yamanaka研究小组于2006年通过重编程技术成功创建。随后中外多家实验室利用转基因方法将多种类型的成体细胞重编程为iPSCs。iPSCs是通过基因转染技术将某些转录因子导入动物或人的体细胞，使体细胞直接重编程成为胚胎干细胞(embryonicstemcell，ES)细胞样的多潜能细胞。iPS细胞不仅在细胞形态、生长特性、干细胞标志物表达等方面与ES细胞非常相似，而且在DNA甲基化方式、基因表达谱、染色质状态、形成嵌合体动物等方面也与ES细胞几乎完全相同。与ES细胞一样，iPSCs能形成密集的集落，并且具有多功能表达基因，表面具有与胚胎干细胞一样的抗原。不仅如此，iPSCs像胚胎干细胞一样具有多向分化潜能，在体内可以分化为3个胚层来源的所有细胞，进而参与形成机体所有组织和器官。基于iPSCs具有多潜能分化的特性，其在生物基础研究领域和生物医学领域都有着巨大的作用。在基础研究方面，利用iPSCs为发育生物学、基因与蛋白质功能分析等领域提供了重要的模型。获得的方法相对简单和稳定，在技术上更具有优势。在生物医学领域方面，如利用患者自身细胞所形成的iPSCs，将其进行特定细胞诱导分化后可以成为细胞的研究材料，解决以往人类组织细胞的提取难题。另外由于细胞来源于患者本身，其具有的“个别性”、“专一性”特性可以成为药剂或是药物毒理评估的最佳平台，也可成为转译医学的最佳测试材料。所以，iPSCs的制作与发现也同样成为了医学、药学以及食品的重要安全实验平台。随着我国人口老龄化日趋严重，脑梗塞、阿尔兹海默病(AD)、帕金森病(PD)等中枢神经系统疾病发病率逐年增高，由于神经细胞受损后再生困难，从而影响了此类疾病的疗效，使得众多老年人晚年生活质量极差，同时也增加了家庭和国家的负担。最近使用细胞重编程技术将iPSCs诱导分化成特异性神经细胞为神经修复和治疗带来了希望。一方面将分化的神经细胞移植到大脑受损区域，可在一定程度上改善该区域神经损伤造成的功能障碍。另一方面使用病人的神经细胞进行相关疾病的机制研究和进行大规模的药物筛选以及为病人提供个性化的精准治疗。未来不管是临床治疗领域还是精准医疗领域都存在对iPSCs诱导神经细胞的大量需求，目前有许多通过干细胞生成神经细胞的方法大多是只在实验室里完成的，且神经细胞的分化效率低，价格高昂，细胞系之间的差异很大，不利于规模化生产和应用，不能满足安全、均质、精准医疗服务和药物检测行业的大量需要。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于克服现有技术的局限，提供一种iPS干细胞体外定向分化为神经细胞的培养基，本专利技术采用的技术方案为：一种用于体外定向诱导多能干细胞分化为神经细胞的试剂盒，所述试剂盒包括前期培养液，所述前期培养液包括基础培养基DMEM/F12，进一步地，所述前期培养液还包括：本专利技术人经过多次改进和尝试，终于发现本专利技术的前期培养液细胞可以抑制细胞分化过程中细胞的死亡，并且可以促进后续神经细胞的分化比例。DMEM/F12是已经商业化的培养基，在该培养基的基础上加入上述比例的各组分，可以明显提高分化效率，虽然详细的作用机制尚有待研究，但应该与这些组分各自调节的基因、蛋白以及信号通路的相互协同的综合作用相关。作为对上述技术方案的进一步改进，其中所述前期培养液还包括：1～3μMTZV或8～12μMY-27632。其中，Y-27632是一种选择性ROCK1(p160ROCK)抑制剂，TZV是四唑紫(tetrazoliumviolet)，前期培养液中含有的TZV或Y-27632用于保证待分化细胞的存活率，避免大量细胞死亡。作为对上述技术方案的进一步改进，所述试剂盒还包括完全神经诱导培养液，所述完全神经诱导培养液包括神经培养基底液和神经诱导补给液，其中所述神经培养基底液和神经诱导补给液的体积比为40:1～60:1；其中所述神经培养基底液为PSC神经培养基底液(英文全称为PSCNeuralInductionBasalmedium，由ThermoFisherScientificInc.生产)；其中所述神经诱导补给液为PSC神经诱导补给液(英文全称为PSCNeuralInductionMediumSupplement，由ThermoFisherScientificInc.生产)。该完全神经诱导培养液与上述的前期培养液相互配合，可以极大地提高神经细胞的分化率。本专利技术的另一个目的在于提供一种用于体外定向诱导多能干细胞分化为神经细胞的方法，所述方法包括以下阶段：第一阶段：用所述的试剂盒中的前期培养液传代培养即将用于定向分化的多能干细胞；第二阶段：用预热的所述的试剂盒中的完全神经诱导培养液替换第一阶段所用的前期培养液，之后每24～48小时更换一次所述完全神经诱导培养液，直至可以采收。作为对上述技术方案的进一步改进，所述方法还包括在第一阶段中，所述多能干细胞以小团块方式传代。当iPSC传代时，细胞需要以小团块方式传代，而不是单个细胞悬浮液，以单个细胞方式传代iPSCs会使细胞死亡率升高。作为对上述技术方案的进一步改进，在第一阶段中，还包括对用于传代培养所述多能干细胞的培养皿进行Geltrex预处理。作为对上述技术方案的进一步改进，在第二阶段中，还包括用无菌的移液管或移液器移除未神经分化的细胞群落。本专利技术的另一目的在于提供一种由上述方法获得的神经前体细胞系或神经细胞系。此外，本专利技术进一步提供了上述神经细胞系在细胞替代治疗、神经疾病治病机制研究以及药物筛选中的应用。本专利技术的试剂盒和方法简单可靠，稳定高效，安全性高，利用本专利技术方法，可成功高效的获得具有生物学活性及功能的神经细胞，且让干细胞向神经细胞分化的比例明显提高，其分化比例大于90％。同时，本专利技术的方法可以大规模生产高品质的神经细胞，无需后续的筛选和纯化步骤，可以直接用于神经发育科学研究，神经疾病的细胞治疗，神经损伤的移植以及药物筛选的应用需求。可诱导多能干细胞的诱导分化研究反映了多能干细胞对外源性因子和微环境的反应的多样性。由于定向分化涉及错综复杂的因子网络,细胞活动收到多种信号间相互作用的调控,这些外源性因子和微环境的相互作用仍需进一步研究。附图说明图1是采用本专利技术一个实施例的方法体外定向分化人源iPS干细胞为神经细胞的免疫染色图。图2为采用本专利技术一个实施例的方法体外定向分化人源iPS干细胞为神经细胞第三天的细胞图。图3为采用本专利技术一个实施例的方法体外定向分化人源iPS干细胞为神经细胞第七天的细胞图。图4为采用本专利技术一个实施例的方法体外定向分化的第一代神经细胞传代第1天的细胞图。图5为采用本专利技术一个实施例的方法体外定向分化的第一代神经细胞传代第四天的细胞图。具体实施方式为更好的说明本专利技术的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步说明。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料为市售商品。本文使用的术语“诱导多能干细胞”，通常缩写本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于体外定向诱导多能干细胞分化为神经细胞的试剂盒，所述试剂盒包括前期培养液，所述前期培养液包括基础培养基DMEM/F12，进一步地，所述前期培养液还包括：胰岛素 4～11/ml；2‑磷酸抗坏血酸酯 40～70mg/ml；亚硒酸钠 40～80ug/ml；人类碱性成纤维细胞生长因子 150～200ug/ml；人类转化生长因子TGFβ1 90～140ug/ml；转铁蛋白 30～60mg/ml；NaHCO

【技术特征摘要】
2016.08.29 CN 20161075090641.一种用于体外定向诱导多能干细胞分化为神经细胞的试剂盒，所述试剂盒包括前期培养液，所述前期培养液包括基础培养基DMEM/F12，进一步地，所述前期培养液还包括：胰岛素4～11/ml；2-磷酸抗坏血酸酯40～70mg/ml；亚硒酸钠40～80ug/ml；人类碱性成纤维细胞生长因子150～200ug/ml；人类转化生长因子TGFβ190～140ug/ml；转铁蛋白30～60mg/ml；NaHCO34～8wt％。2.如权利要求1所述的试剂盒，其中所述前期培养液还包括：1～3μMTZV或8～12μMY27632。3.如权利要求1所述的试剂盒，所述试剂盒还包括完全神经诱导培养液，所述完全神经诱导培养液包括神经培养基底液和神经诱导补给液，其中所述神经培养基底液和神经诱导补给液的体积比为40...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘淳刚，池锦焕，
申请(专利权)人：广东依浦赛生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44