本发明专利技术提供了一种人源iPS干细胞体外定向分化为心肌细胞的试剂盒及方法，利用本发明专利技术试剂盒所提供的培养液以及按照本发明专利技术方法可以使iPS干细胞高效地、定向地分化为心肌细胞。本发明专利技术的试剂盒和方法简单可靠，稳定高效，安全性高，多能干细胞向心肌细胞分化的比例明显提高，其分化比例大于90％。同时，本发明专利技术的试剂盒和培养基适用于大规模生产高品质的心肌细胞，无需后续的筛选和纯化步骤，可以直接用于心脏发育科学研究，心脏疾病的细胞治疗，心脏损伤的移植以及药物筛选的应用需求。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及干细胞生物学与再生医学领域，具体地涉及一种人源iPS干细胞体外定向分化为心肌细胞的试剂盒及方法。
技术介绍
随着中国人口日益老龄化，心血管疾病成为对健康构成极大威胁的一类疾病。在我国，心血管病死亡率列第二位，每年死于心血管疾病的约有300万人，尤其是冠心病导致的心肌梗死疾病会造成部分心肌缺血而坏死，导致病人引发心脏心律不齐，泵血不足，严重威胁国人健康和生活质量，目前只有用ES细胞(胚胎干细胞)分化来的心肌细胞进行贴片替换治疗才是可行的治疗方法。然而，ES细胞供体卵母细胞的来源困难，且细胞建系效率低，甚至存在免疫排斥反应，而且，ES细胞和治疗性克隆研究还存在伦理学争论，以致ES细胞无法大面积地被采用。同时患有各类心血管疾病危险因素的人群至少2.3亿人，我国心脑血管疾病用药市场总规模保持快速增长的势头，年均复合增长率超过25％并呈逐年上升的趋势。因此，相对应的在制药CRO市场就需要大量的心肌细胞来满足心肌药物的筛选。目前有许多通过ES细胞生成心肌细胞的方法大多是只在实验室里完成的，不能满足安全、均质、大规模化生产的需要。因此，为了能满足未来CRO产业化大规模生产和细胞治疗的需求，开发出一种安全、可大规模生产的心肌细胞分化方法成为细胞再生领域亟待解决的一个现实问题。iPS细胞不仅在细胞形态、生长特性、干细胞标志物表达等方面与ES细胞非常相近，而且在DNA甲基化方式、基因表达谱、染色质状态、形成嵌合体动物等方面也与ES细胞几乎完全相同，其自我更新能力较强，且具有高度的分化能力。目前，iPS细胞可在体外被诱导生成所有210种构成人体的细胞，具有无限的疾病治疗前景。理论上，iPS细胞培养出的组织或器官移植回原患者身体内时，可避开自身免疫系统的攻击难题，同时以往ES细胞所产生的道德伦理问题也可以取得根本解决。因此，iPS细胞成为了再生医学中备受瞩目的重要细胞来源。除了再生医学之应用外，还可以利用患者自身细胞所形成的iPS细胞，将其进行特定细胞诱导分化后可以成为细胞的研究材料，解决以往人类组织细胞的提取难题。另外由于细胞来源于患者本身，其具有的“个别性”、“专一性”特性可以成为药剂或是药物毒理评估的最佳平台，也可成为转译医学的最佳测试材料。所以，iPS细胞的制作与发现也同样成为了医学、药学以及食品的重要安全实验平台。虽然，目前有很多方法可以将iPS细胞定向分化为心肌细胞，但是心肌细胞的分化效率低，价格高昂，细胞系之间的差异很大，不利于规模化生产和应用。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于克服现有技术的局限，提供一种iPS干细胞体外定向分化为心肌细胞的培养基，本专利技术采用的技术方案为：一种用于体外定向诱导多能干细胞分化为心肌细胞的试剂盒，所述试剂盒包括第一培养液，所述第一培养液包括基础培养基DMEM/F12，进一步地，所述第一培养液还包括：胰岛素4～11/ml；2-磷酸抗坏血酸酯40～70mg/ml；亚硒酸钠40～80ug/ml；人类碱性成纤维细胞生长因子150～200ug/ml；人类转化生长因子TGFβ1 90～140ug/ml；转铁蛋白30～60mg/ml；NaHCO3 4～8wt％。本专利技术人经过多次改进和尝试，终于发现本专利技术的第一培养液细胞可以抑制细胞分化过程中细胞的死亡，并且可以促进后续心肌细胞的分化比例。DMEM/F12是已经商业化的培养基，在该培养基的基础上加入上述比例的各组分，可以明显提高分化效率，虽然详细的作用机制尚有待研究，但应该与这些组分各自调节的基因、蛋白以及信号通路的相互协同的综合作用相关。作为对上述技术方案的进一步改进，其中所述第一培养液还包括：1～3μM TZV或8～12μM Y-27632。其中，Y-27632是一种选择性ROCK1(p160ROCK)抑制剂，TZV是四唑紫(tetrazolium violet)，第一培养液中含有的TZV或Y-27632用于保证待分化细胞的存活率，避免大量细胞死亡。作为对上述技术方案的进一步改进，其中所述第一培养液的pH值小于7。确保第一培养液颜色为红色，而不是紫色(碱性)。如果培养液为紫色，加入50～100μg/ml抗坏血酸或松动盖子后在37℃5％CO2培养箱中预热。在ips细胞培养分化过程中，酸碱度的变动过大会导致细胞死亡。作为对上述技术方案的进一步改进，所述试剂盒还包括第二培养液，所述第二培养液包括CDM培养液，进一步地，所述第二培养液还包括8～12μM的CHIR99021；其中所述CDM培养液包括基础培养基RPMI-1640，0.08～0.12％BSA，1×MTG、200～250μg/mL抗坏血酸磷酸酯镁。在分化初始阶段加入肝糖原合成激酶3β(GSK3β)受体的选择性抑制剂CHIR99021可以激活Wnt/β-catenin信号通路提高心肌细胞的分化比率。作为对上述技术方案的进一步改进，所述试剂盒还包括第三培养液，所述第三培养液包括CDM培养液，进一步地，所述第三培养液还包括4～6ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子；其中所述CDM培养基包括基础培养基RPMI-1640，0.08～0.12％BSA，1×MTG、200～250μg/mL抗坏血酸磷酸酯镁。在培养液中加入约5ng/ml作用的bFGF(最终浓度)小分子化合物，可一定程度的增加转化后细胞的成活率和心肌细胞分化的效率。作为对上述技术方案的进一步改进，所述试剂盒还包括第四培养液，所述第四培养液包括CDM培养液和已经使用过的第三培养液，进一步地，所述第四培养液还包括2～8μM的IWP2/4、1～3μM的IWR-1、或1～3μM的Wnt-C59；其中，所述述CDM培养基包括基础培养基RPMI-1640，0.08～0.12％BSA，1×MTG、200～250μg/mL抗坏血酸磷酸酯镁；其中，所述CDM培养液和已经使用过的第三培养液的体积比为0.5～2。优选地，所述第四培养液含有的是IWP2/4，其可以在一定程度上加速心肌细胞的分化。优选的，所述第四培养液含有的是IWR-1，IWR-1对分化后的细胞有一定毒性，虽然成活细胞较少，但在三周时，相比用IWP2/4，使用IWR-1的心肌细胞的纯度较高。在本专利技术中，“已经使用过的第三培养液”是指分化过程中将第三培养液用于培养细胞后收集起来的细胞培养液，该细胞液中含有细胞培养过程中一些细胞分泌的活性因子，使用一部分(约30～70vol％)该细胞液和新的CDM培养液构成的混合培养液有助于细胞存活率，从而促进心肌细胞的分化。作为对上述技术方案的进一步改进，所述试剂盒还包括第五培养液，所述第五培养液为CDM培养液，或所述第五培养液包括基础培养基RPMI-1640以及2～4％的KOSR或2～4％的B27；其中所述CDM培养基包括基础培养基RPMI-1640，0.08～0.12％BSA，1×MTG、200～250μg/mL抗坏血酸磷酸酯镁。其中，B27是一种血清替代物，用于细胞生长，尤其适用于大鼠海马和皮质神经元的长期培养。KOSR也是一种血清替代物。本专利技术的另一个目的在于提供一种用于体外定向诱导多能干细胞分化为心肌细胞的方法，所述方法包括以下阶段：第一阶段：用所述的试剂盒中的第一培养液传代培养即将用于定向分化的多能干本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于体外定向诱导多能干细胞分化为心肌细胞的试剂盒，所述试剂盒包括第一培养液，所述第一培养液包括基础培养基DMEM/F12，进一步地，所述第一培养液还包括：胰岛素 4～11/ml；2‑磷酸抗坏血酸酯 40～70mg/ml；亚硒酸钠 40～80ug/ml；人类碱性成纤维细胞生长因子 150～200ug/ml；人类转化生长因子TGFβ1 90～140ug/ml；转铁蛋白 30～60mg/ml；NaHCO3 4～8wt％。
【技术特征摘要】
1.一种用于体外定向诱导多能干细胞分化为心肌细胞的试剂盒，所述试剂盒包括第一培养液，所述第一培养液包括基础培养基DMEM/F12，进一步地，所述第一培养液还包括：胰岛素 4～11/ml；2-磷酸抗坏血酸酯 40～70mg/ml；亚硒酸钠 40～80ug/ml；人类碱性成纤维细胞生长因子 150～200ug/ml；人类转化生长因子TGFβ1 90～140ug/ml；转铁蛋白 30～60mg/ml；NaHCO3 4～8wt％。2.如权利要求1所述的试剂盒，其中所述第一培养液还包括：1～3μM TZV或8～12μM Y-27632。3.如权利要求1所述的试剂盒，其中所述第一培养液的pH值小于7。4.如权利要求1所述的试剂盒，所述试剂盒还包括第二培养液，所述第二培养液包括CDM培养液，进一步地，所述第二培养液还包括8～12μM的CHIR99021；其中所述CDM培养液包括基础培养基RPMI-1640，0.08～0.12％BSA，1×MTG、200～250μg/mL抗坏血酸磷酸酯镁。5.如权利要求1所述的试剂盒，所述试剂盒还包括第三培养液，所述第三培养液包括CDM培养液，进一步地，所述第三培养液还包括4～6ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子；其中所述CDM培养基包括基础培养基RPMI-1640，0.08～0.12vol％BSA，1×MTG、200～250μg/mL抗坏血酸磷酸酯镁。6.如权利要求1所述的试剂盒，所述试剂盒还包括第四培养液，所述第四培养液包括CDM培养液和已经使用过的第三培养液，进一步地，所述第四培养液还包括2～8μ...
【专利技术属性】
技术研发人员：潘淳刚，池锦焕，
申请(专利权)人：广东依浦赛生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44
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