本发明专利技术公开了一种诱导鸡前脂肪细胞分化的CBH培养基及其分化方法，在现有培养基中加入如下成份：20μg/mL牛胰岛素，1μM地塞米松，0.5mM 3‑异丁基‑1‑甲基黄嘌呤及5μM罗格列酮。分离培养鸡原代前脂肪细胞，当细胞在生长培养基中达到50％汇合时，将细胞分为对照组和诱导组。对照组仍然使用生长培养基，而诱导组将生长培养基更换为CBH培养基，每天分别更换培养基，总共诱导6天。结果显示：诱导组细胞中的脂滴沉积，GPDH活性及aP2、G0S2、PPARγmRNA的表达水平均极显著地高于对照组，表明CBH培养基能够诱导鸡前脂肪细胞分化。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于动物细胞生物学领域，特别是涉及一种诱导鸡前脂肪细胞分化的CBH培养基及其分化方法。
技术介绍
脂肪过度沉积是现代肉鸡产业面临的主要难题之一，而脂肪含量的增加来源于脂肪细胞数量的增加和体积的增大。多能干细胞向前脂肪细胞定向以及前脂肪细胞的增殖均可导致脂肪细胞数量的增加，前脂肪细胞的分化则可导致脂肪细胞体积的增大。前脂肪细胞分化这一生物学过程已在哺乳动物前脂肪细胞系3T3-L1和3T3-F442A中被广泛研究。许多转录因子参与哺乳动物前脂肪细胞分化，其中最重要的转录因子是过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR)γ。PPARγ是配体依赖型受体，研究发现，PPARγ的配体(或称激动剂)罗格列酮(rosiglitazone)、曲格列酮(troglitazone)、吲哚美辛(indomethacin)参与调控哺乳动物前脂肪细胞的分化和脂类代谢。由于鸟类和哺乳动物在脂肪生成的调控上存在差异，因此，研究鸡前脂肪细胞分化的生理特点和分子事件不仅能够帮助我们了解不同物种间脂肪细胞发育的异同，还可为深入研究肉鸡脂肪沉积奠定分子基础。前脂肪细胞分化产生具有功能的成熟脂肪细胞，成熟脂肪细胞具有以下特性：脂肪细胞特异性基因表达水平增加、脂肪合成酶活性增加、脂滴沉积增加。在哺乳动物中，激素混合物(hormone cocktail)被广泛用来诱导前脂肪细胞分化，其成分包括胰岛素(insulin，INS)、地塞米松(dexamethasone，DEX)和3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX)，但激素混合物不能诱导鸡前脂肪细胞分化。油酸能够诱导鸡前脂肪细胞分化，但研究表明，油酸诱导分化的前脂肪细胞在功能上具有有缺陷性。虽然单独的激素混合物不能诱导鸡前脂肪细胞分化，但我们仍需设法在激素混合物中添加某种物质来尝试将鸡前脂肪细胞诱导分化为具有功能的成熟脂肪细胞。研究发现，在激素混合物中添加PPARβ/δ激动剂GW501516不能促进鸡前脂肪细胞中aP2的表达水平，但在激素混合物中同时添加PPARβ/δ激动剂GW501516和PPARγ激动剂曲格列酮能够促进鸡前脂肪细胞中aP2的表达水平及3-磷酸甘油脱氢酶(glycerol-3-phosphate dehydrogenase，GPDH)的活性，但不能促进脂滴沉积，因此，使用该方法诱导分化的前脂肪细胞在功能上仍有缺陷。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供了一种诱导鸡前脂肪细胞分化的CBH培养基及其分化方法。一种诱导鸡前脂肪细胞分化的CBH培养基，现有生长培养基配方为：体积分数10％胎牛血清，100units/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM/F12，其特征在于，在现有生长培养基中加入如下成分：20μg/mL牛胰岛素，1μM地塞米松，0.5mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤及5μM罗格列酮。本专利技术还具有如下技术特征：采用如上所述的CBH培养基得出的一种诱导鸡前脂肪细胞分化方法如下：(1)分离培养鸡原代前脂肪细胞；(2)当鸡前脂肪细胞在生长培养基中达到50％汇合时，将细胞分为对照组和诱导组；对照组仍然使用生长培养基，而诱导组将生长培养基更换为CBH培养基；(3)诱导组和对照组每天更换一次新鲜的培养基，总共诱导6天。本专利技术有益效果：本专利技术证明CBH培养基能够诱导鸡前脂肪细胞分化，包括促进前脂肪细胞中脂滴的沉积(P<0.01)、GPDH的活性(P<0.01)以及aP2(P<0.01)、G0S2(P<0.01)、PPARγ(P<0.01)mRNA的表达水平，本专利技术中诱导组细胞中脂滴沉积、GPDH活性、aP2、G0S2、PPARγmRNA表达水平均极显著高于对照组。本专利技术所提供的方法具有操作简单、费用低的特点，是一种有效的诱导鸡前脂肪细胞分化的方法，为鸡前脂肪细胞的分化的研究奠定了基础。附图说明图1为对照组与诱导组细胞形态的比较。图2为对照组与诱导组细胞中脂滴沉积的比较。图3为对照组与诱导组细胞中GPDH活性的比较。图4为对照组与诱导组细胞中aP2、G0S2、PPARγmRNA表达水平的比较。具体实施方式下面结合实施例及附图对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。实施例1鸡原代前脂肪细胞的分离培养取10日龄商品AA肉仔鸡，无菌采取腹部脂肪组织，放入装有PBS(含青霉素100units/mL和链霉素100μg/mL)的平皿中，反复冲洗，尽可能去除筋膜和血管，然后用眼科剪剪碎组织，之后在2mg/mL的Ⅰ型胶原酶中，于37℃消化65min(每5min震荡一次)。消化完毕后，加入生长培养基(体积数10％胎牛血清，100units/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM/F12)终止消化，移液器吹打，分别经100目和600目的不锈钢筛网过滤。滤液分装入15mL离心管，2000r/m离心10min，除去培养液，用红细胞裂解液重悬细胞，制成细胞悬液，室温孵育10min，2000r/m离心10min，细胞沉淀用生长培养基重悬，2000r/m离心10min，再用生长培养基重悬后的细胞悬液就是基质-血管(S-V)细胞，即前脂肪细胞。将分离的前脂肪细胞计数后，按1×104个/mL的密度将细胞接种到细胞培养板中，于CO2培养箱中培养。实施例2鸡原代前脂肪细胞的诱导分化当鸡前脂肪细胞在生长培养基中达到50％汇合时，将细胞分为2组(对照组和诱导组)，对照组仍然使用生长培养基，而诱导组将生长培养基更换为CBH培养基。对照组和诱导组每天更换一次新鲜的生长培养基和CBH培养基，总共诱导6天。现有生长培养基配方为：体积分数10％胎牛血清，100units/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM/F12诱导培养基含激素混合物：20μg/mL牛胰岛素，1μM地塞米松，0.5mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤及5μM罗格列酮。实施例3脂滴沉积效果的比较弃去实施例2中所述培养基，经PBS洗3次，10％的福尔马林固定30min，PBS洗3次，蒸馏水洗3次，32℃干燥，1％油红O染液染色40min，PBS洗3次，100％异丙醇溶解细胞中的油红O 15min，酶标仪510nm记录光吸收值，用细胞数量校正结果。诱导6天后，利用倒置显微镜观察对照组与诱导组的细胞形态，如图1所示，可见诱导组细胞中沉积大量脂滴，而对照组细胞中几乎没有脂滴。如图2所示，油红O提取比色结果表明，诱导组细胞中脂滴的沉积显著多于对照组细胞(P<0.01)。实施例43-磷酸甘油脱氢酶(GPDH)活性检测弃去实施例2中所述培养基，经PBS洗3次，按照GPDH Activity Assay Kit说明书检测细胞中GPDH的活性，用蛋白含量校正结果。诱导6天后，如图3所示，GPDH活性分析结果表明，诱导组细胞中GPDH的活性显著高于对照组细胞(P<0.01)。实施例5脂肪生成相关基因mRNA表达水平的比较1、引物的设计与合成根据鸡β-actin、aP2、G0S2、PPARγ基因CDS区设计Real-time qRT本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种诱导鸡前脂肪细胞分化的CBH培养基，现有生长培养基配方为：体积分数10％胎牛血清，100units/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM/F12，其特征在于，在现有生长培养基中加入如下成分：20μg/mL牛胰岛素，1μM地塞米松，0.5mM 3‑异丁基‑1‑甲基黄嘌呤及5μM罗格列酮。
【技术特征摘要】
1.一种诱导鸡前脂肪细胞分化的CBH培养基，现有生长培养基配方为：体积分数10％胎牛血清，100units/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM/F12，其特征在于，在现有生长培养基中加入如下成分：20μg/mL牛胰岛素，1μM地塞米松，0.5mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤及5μM罗格列酮。2.根据...
【专利技术属性】
技术研发人员：李辉，程博涵，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23
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