本发明专利技术公开了一种培养及诱导罗非鱼腹腔前脂肪细胞的方法，包括如下步骤：a)用含10％～15％胎牛血清的DMEM/F12培养基重悬细胞；接种于细胞板中，20～30℃、5％CO2条件下进行培养，培养7天时间；b)更换诱导培养基继续培养，诱导7‑14天后，对细胞进行油红O染色，显微镜下可见细胞膜边缘较为模糊，胞内被染为红色的脂滴；本发明专利技术还提出了对罗非鱼腹腔前脂肪细胞进行传代的方法，用增殖培养基培养前脂肪细胞14～20天后，以2～3×105个/ml接种，培养2～3天，细胞可长满细胞板。本发明专利技术的方法可以成功地对罗非鱼腹腔前脂肪细胞进行体外培养、诱导及传代，为罗非鱼脂代谢的研究提供了技术参考。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及水生动物营养
，具体涉及一种培养及诱导罗非鱼腹腔前脂肪细胞的方法。
技术介绍
自1962年Wolf等人建立了第一个鱼类细胞系，即虹鳟鱼(Oncorhynchusmykiss)生殖腺细胞系RTG-2以来，鱼类细胞培养技术不断发展成熟，从最初的用于鱼类病毒的分离、鉴定以及病毒疫苗的制备到目前环境毒理学、鱼类肿瘤学、生理学、内分泌学、遗传学和资源保护等方面的应用，鱼类细胞培养技术得到了广泛的应用。其主要原因在于，鱼类细胞培养作为一种新兴技术有着活体鱼养殖无法比拟的独特优势：(1)成本低；细胞系培养和保存无需较多的人力资源，且细胞培养标准化程度高，变异程度低(2)真实性与快速性；离体培养的原代细胞其生理功能接近在体状态，且实验周期短，不受实验动物生长周期的影响，可短期内快速得到实验结果。(3)可重复性好；离体培养细胞，可以精确控制实验条件，排除其他因素对实验结果的干扰，可以有针对性的开展实验研究。鱼类中脂肪组织是主要的储能部位，脂肪组织在调控能量平衡中发挥了重大作用：既可以作为储能场所储存多余的能量，也可以在能量供应不足的情况下作为能量来源，释放脂肪酸提供能量。和哺乳动物类似的是，在鱼类中，脂肪组织的产生和脂质沉积是受基因，环境以及饮食因素的共同影响，由此引发脂肪细胞增殖和分化，从而导致脂肪组织肥大。因此，构建脂肪细胞体外培养体系，研究脂肪细胞分化过程，是探讨生物体脂质代谢规律的重要手段。而与细胞系相比，原代脂肪细胞是直接从生物体内获得且生长在一个相对简单的环境中，更能反映生物体的状态。目前，哺乳动物方面已经构建了大鼠、人、牛和猪的前体脂肪模型，而鱼类脂肪细胞体外培养的研究工作刚开始不久。国外已开展了虹鳟、大西洋鲑、真鲷脂肪细胞培养的研究，而国内的工作仍处于起步阶段。罗非鱼(Tilapia)原产于非洲，是一种热带内陆性鱼类。其生长快，产量高，耐低氧，适应性和抗病力强，在淡咸水中均能生存。目前已成为世界性的主要养殖鱼类。随着罗非鱼的市场需求增大，水产养殖也朝着集约化方向发展，而淡水养殖过程中，养殖户为了提高罗非鱼产量，大量投喂高脂饲料，造成鱼类脂肪大量沉积，鱼类抗病能力下降，因此，研究罗非鱼脂肪组织的发生和代谢就尤为重要。到目前为止，罗非鱼的脂肪细胞培养体系的建立尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术提供了一种培养罗非鱼前脂肪细胞，并诱导其分化为成熟的脂肪细胞的方法。该方法具有快速、可有效保留前细胞活性等优点，为研究罗非鱼脂代谢提供了新的研究思路和技术手段。本专利技术中所采用的DMEM/F12培养基的成分为：本专利技术提出了一种增殖培养基，在DMEM/F12培养基中加入10％～15％(体积百分比)的胎牛血清。优选地，加入胎牛血清的体积百分比为15％。优选地，所述增殖培养基可以进一步加入1％(体积百分比)双抗，其中所述双抗为100单位的青霉素和100μg链霉素。本专利技术提出了一种诱导培养基，包括：在DMEM/F12培养基中加入10～15％(体积百分比)胎牛血清和0.1％～1％(质量百分比)牛血清白蛋白，15μg/ml胰岛素(insulin)，0.2mM吲哚美辛(Indo)，1μM地塞美松(DEX)，0.5μM1-甲基-3-异丁基黄嘌呤(IBMX)。优选地，所述诱导培养基，包括：在DMEM/F12培养基中加入15％(体积百分比)胎牛血清和0.1％(质量百分比)牛血清白蛋白，15μg/ml胰岛素(insulin)，0.2mM吲哚美辛(Indo)，1μM地塞美松(DEX)，0.5μM1-甲基-3-异丁基黄嘌呤(IBMX)。本专利技术还提出了一种对罗非鱼前脂肪细胞增殖培养的方法，包括：用上述增殖培养基重悬细胞；接种于细胞板中，20～30℃、5％CO2条件下进行培养5-7天。其中，所述培养的温度优选地为28℃；培养的CO2浓度为5％；优选地为，每4天换液一次；接种细胞的浓度范围为2～3×105个/ml；优选地，为2.5×105个/ml培养5～7天时，细胞长至汇合阶段；优选地，所述培养的时间为7天。本专利技术还提出了一种诱导罗非鱼前脂肪细胞的方法，所述方法包括如下步骤：a)用上述增殖培养基重悬细胞；接种于细胞板中，20～30℃、5％CO2条件下进行培养5-7天；b)更换上述诱导培养基，诱导7～14天。其中，所述步骤a)中，所述培养的温度优选地为28℃；培养的CO2浓度为5％；优选地为，每4天换液一次；接种细胞的浓度范围为2～3×105个/ml；优选地，为2.5×105个/ml培养5～7天时，细胞长至汇合阶段；优选地，所述培养的时间为7天。其中，所述步骤b)中，所述诱导的温度优选地为28℃；所述诱导的时间优选地为12天；对细胞进行油红O染色，显微镜下观察油红染色结果，可见诱导成功的罗非鱼前脂肪细胞的细胞膜边缘较为模糊，胞内脂滴被染为红色。本专利技术还提出了一种对罗非鱼前脂肪细胞传代的方法：1)用上述增殖培养基重悬细胞；接种于细胞板中，20～30℃、5％CO2条件下进行培养14-20天。2)用上述增殖培养基将步骤1)培养的前脂肪细胞，用0.12％的胰蛋白酶消化，重悬，以2～3×105个/ml接种，在上述增殖培养基中，20～30℃条件下培养2～3天。其中，所述步骤1)中，所述培养的温度优选地为28℃；培养的CO2浓度为5％；优选地为，每4天换液一次；接种细胞的浓度范围为2～3×105个/ml；优选地，为2.5×105个/ml优选地，所述培养的时间为2～3，优选地为，3天。本专利技术步骤1)中对罗非鱼增殖培养的时间为14-20天，若培养低于14天，细胞传代后无法正常增殖，最终细胞全部死亡。其中，所述步骤2)中，所述增殖培养基与步骤1)中增殖培养基组成相同；所述培养的温度优选地为28℃；培养的CO2浓度为5％；优选地为，每4天换液一次；接种细胞的浓度范围为2～3×105个/ml；优选地，为2.5×105个/ml，所述培养2～3天时，细胞长至汇合阶段，细胞可长满细胞板。本专利技术的一个具体实施例包括如下步骤：(1)将刚刚死亡的罗非鱼(700～900g)，剪断鳃弓；(2)无菌条件下，快速分离出肠系膜周围的脂肪组织，直接放入Krebs-Henseleit缓冲液中，清洗三次，剪碎置于离心管中，再加入等体积的消化酶于28℃水浴震荡消化1h；(3)用100目的尼龙膜过滤悬浮的脂肪细胞，除去结缔组织，清洗三次；(4)加入红细胞裂解液除去血细胞，用含胎牛血清的DMEM/F12培养基重悬细胞。接种于细胞板中，28℃，5％CO2条件下进行培养，每4天换液一次，待细胞长至汇合阶段，更换诱导培养基继续培养。(5)诱导12天后对细胞进行油红O染色，显微镜下观察油红染色结果。在本专利技术的实验方案中，所述的消化酶是II型胶原酶，浓度是1％。本专利技术的另一个实施例包括，将上述步骤(4)的前脂肪细胞培养14-20天后，用0.12％的胰蛋白酶消化，重悬，以2～3×105个/ml接种，培养2～3天，细胞可长满细胞板。本专利技术还提出了将所述增殖培养基用于对罗非鱼前脂肪细胞增殖培养的应用。本专利技术还提出了将所述增殖培养基用于对罗非鱼前脂肪细胞增殖培养和诱导中的应用。本专利技术还提出了将所述增殖培养基在对罗非鱼前脂肪细胞传代中的应用。本专利技术提出了将所述诱导培养基本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种增殖培养基，其特征在于，在DMEM/F12培养基中加入10％～15％(体积百分比)的胎牛血清。
【技术特征摘要】
1.一种增殖培养基，其特征在于，在DMEM/F12培养基中加入10％～15％(体积百分比)的胎牛血清。2.如权利要求1所述的增殖培养基，其特征在于，加入胎牛血清的体积百分比为15％。3.如权利要求1所述的增殖培养基，其特征在于，所述增殖培养基可以进一步加入1％(体积百分比)双抗，其中所述双抗为100单位的青霉素和100μg链霉素。4.一种诱导培养基，其特征在于，在DMEM/F12培养基中加入10～15％(体积百分比)胎牛血清和0.1％～1％(质量百分比)牛血清白蛋白，15μg/ml胰岛素，0.2mM吲哚美辛，1μM地塞美松，0.5μM1-甲基-3-异丁基黄嘌呤。5.一种对罗非鱼前脂肪细胞增殖培养的方法，其特征在于，用上述增殖培养基重悬细胞；以2～3×105个/ml的密度接种于细胞板中，20～30℃、5％CO2条件下进行培养5-7天；其中，所述增殖培养基为，在DMEM/F12培养基中加入10％～15％(体积百分比)的胎牛血清。6.一种诱导罗非鱼前脂肪细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：a)用上述增殖培养基重悬细胞；接种于细胞板中，20～30℃、5％CO2条件下进行培养5-7天；b)更换上述诱导...
【专利技术属性】
技术研发人员：杜震宇，王雅文，乔芳，
申请(专利权)人：华东师范大学，
类型：发明
国别省市：上海;31
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