一种成骨诱导培养基及骨向分化方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，特别涉及一种成骨诱导培养基及骨向分化方法。该成骨诱导培养基包括维生素C、地塞米松、β‑甘油磷酸钠、胰岛素样生长因子‑1、碱性成纤维生长因子和基础培养基。本发明专利技术成骨诱导培养基中多种诱导因子联合应用作用于hAMSCs等间充质干细胞，能有效的诱导间充质干细胞骨向分化，其成骨分化效果显著优于现有常规的诱导方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，特别涉及一种成骨诱导培养基及骨向分化方法。
技术介绍
间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)是来源于中胚层的多能干细胞，具有高度自我更新能力和多向分化潜能。目前已在多种成熟组织中成功分离培养出间充质干细胞，如骨髓、脐带、肌肉组织、脂肪组织、脐血、牙髓等。人胎盘来源的羊膜组织作为孕妇分娩后的废弃物，来源广、增殖快且不受伦理道德限制，是近几年的研究热点。羊膜是胎盘包裹胎儿面的一层半透明膜，其表面没有神经、血管、肌肉和淋巴等组织，可分离出羊膜上皮细胞和羊膜间充质干细胞。早在50多年前，科学家和临床医生们就已经认识到羊膜拥有一定的生物学作用。早期羊膜曾被用作覆盖皮肤伤口的敷料，可以抗感染、减轻炎症的发生，并且抑制细胞的免疫反应，还可以刺激血管的生成。这些特点使它在多种疾病的辅助治疗中得到了较为广泛的应用，例如治疗烧伤，覆盖手术伤口，更重要的是用于眼表重建术。其中人胎盘羊膜来源的间充质干细胞(humanamnionmesenchymalcells,hAMSCs)来自于原条期的胚外中胚层，具有在一定条件下向多个细胞系分化潜能，向内胚层分化，如肝细胞、胰岛样细胞；向中胚层分化，如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞；向外胚层分化，如神经细胞等。hAMSCs不仅具有干细胞的特征，且具有不排斥性及免疫效果，是细胞移植和组织工程的理想种子细胞。这种材料来源丰富、细胞来源无争议，在骨治疗、脏器治疗、心肌修复和神经组织重新构造中具有广阔科研前景。目前对于hAMSCs成骨分化诱导的研究主要集中于不同细胞因子对其生物学行为产生的不同影响，但是往往局限于单一细胞因子对其作用的研究，或是维生素C、地塞米松、β-甘油磷酸钠三种因子联合诱导的传统间充质干细胞成骨分化诱导方法。对于诱导能力更强的诱导因子及方法仍有需求。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种成骨诱导培养基及骨向分化方法。该成骨诱导培养基包括维生素C、地塞米松、β-甘油磷酸钠、胰岛素样生长因子-1、碱性成纤维生长因子等诱导因子，多种诱导因子联合应用作用于hAMSCs等间充质干细胞，能有效的诱导间充质干细胞骨向分化，其成骨分化效果显著优于现有常规的诱导方法。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种成骨诱导培养基，包括维生素C、地塞米松、β-甘油磷酸钠、胰岛素样生长因子-1、碱性成纤维生长因子和基础培养基。目前，现有的常规成骨诱导培养基包括维生素C、地塞米松和β-甘油磷酸钠，本专利技术提供的成骨诱导培养基在常规诱导因子组合的基础上，添加胰岛素样生长因子-1和碱性成纤维生长因子，多种诱导因子联合应用作用于hAMSCs等间充质干细胞，更加高效的诱导hAMSCs等间充质干细胞的骨向分化。作为优选，成骨诱导培养基中各组分的用量为：维生素C：10～100μg/L；地塞米松：(1～10)×10-8mol/L；β-甘油磷酸钠：1～20mol/L；胰岛素样生长因子-1：5～20μg/L；碱性成纤维生长因子：5～20μg/L；基础培养基：补足。优选地，成骨诱导培养基中各组分的用量为：维生素C：50μg/L；地塞米松：1×10-8mol/L；β-甘油磷酸钠：10mol/L；胰岛素样生长因子-1：5～20μg/L；碱性成纤维生长因子：5～20μg/L；基础培养基：补足。更优选地，成骨诱导培养基中各组分的用量为：维生素C：50μg/L；地塞米松：1×10-8mol/L；β-甘油磷酸钠：10mol/L；胰岛素样生长因子-1：15μg/L；碱性成纤维生长因子：15μg/L；基础培养基：补足。在本专利技术提供的实施例中，基础培养基为含有10％体积分数FBS的低糖DMEM培养基。本专利技术还提供了一种诱导间充质干细胞骨向分化的方法，采用本专利技术提供的成骨诱导培养基培养间充质干细胞。在本专利技术提供的实施例中，间充质干细胞为羊膜间充质干细胞。作为优选，间充质干细胞为第2～5代间充质干细胞。在本专利技术提供的实施例中，间充质干细胞为第3代间充质干细胞。作为优选，间充质干细胞的接种密度为(1～10)×104cell/mL。在本专利技术提供的实施例中，间充质干细胞的接种密度为2×104cell/mL。作为优选，间充质干细胞的培养温度为37℃。作为优选，间充质干细胞的培养时间不低于14天。优选地，间充质干细胞的培养时间不低于21天。本专利技术提供了一种成骨诱导培养基及骨向分化方法。该成骨诱导培养基包括维生素C、地塞米松、β-甘油磷酸钠、胰岛素样生长因子-1、碱性成纤维生长因子和基础培养基。本专利技术至少具有如下优势之一：1)本专利技术提供一种由多种诱导因子联合应用作用于hAMSCs等间充质干细胞，具有协同作用，能有效的诱导间充质干细胞骨向分化，其成骨分化效果显著优于现有常规的诱导方法。2)本专利技术采用的原材料是胎盘来源的羊膜组织，胎盘作为孕妇分娩后的废弃物，目前基本作为医疗废弃物而扔掉；而本专利技术用于分离培养hAMSCs，进行骨向诱导，有效实现了医疗废弃物的再利用。3)本专利技术采用的原材料是胎盘来源的羊膜组织，来源广、增殖快且不受伦理道德限制。附图说明图1示hAMSCs表面抗原流式检测结果；其中，1-1～1-6分别示CD105、HLA-DR、CD90、CD34、CD73、CD45的阳性表达率；图2示对照组和实验组诱导培养21d、28d的细胞染色效果图；其中，2-1～2-4分别示对照组1中细胞诱导21天放大40倍、诱导21天放大100倍、诱导28天放大40倍、诱导28天放大100倍的图片；2-5～2-8分别示对照组2中细胞诱导21天放大40倍、诱导21天放大100倍、诱导28天放大40倍、诱导28天放大100倍的图片；2-9～2-12分别示对照组3中细胞诱导21天放大40倍、诱导21天放大100倍、诱导28天放大40倍、诱导28天放大100倍的图片；2-13～2-16分别示对照组4中细胞诱导21天放大40倍、诱导21天放大100倍、诱导28天放大40倍、诱导28天放大100倍的图片；2-17～2-20分别示实验组1中细胞诱导21天放大40倍、诱导21天放大100倍、诱导28天放大40倍、诱导28天放大100倍的图片；2-21～2-24分别示实验组2中细胞诱导21天放大40倍、诱导21天放大100倍、诱导28天放大40倍、诱导28天放大100倍的图片；2-25～2-28分别示实验组3中细胞诱导21天放大40倍、诱导21天放大100倍、诱导28天放大40倍、诱导28天放大100倍的图片；2-29～2-32分别示实验组4中细胞诱导21天放大40倍、诱导21天放大100倍、诱导28天放大40倍、诱导28天放大100倍的图片；2-33～2-36分别示实验组5中细胞诱导21天放大40倍、诱导21天放大100倍、诱导28天放大40倍、诱导28天放大100倍的图片；图3示对照组和实验组中细胞矿化面积比较；图4示不同时间点对照组和实验组的细胞碱性磷酸酶活性比较；图5示对照组和实验组的OCN、Col-I、Runx2表达水平比较。具体实施方式本专利技术公开了一种成骨诱导培养基及骨向分化方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种成骨诱导培养基，其特征在于，包括维生素C、地塞米松、β‑甘油磷酸钠、胰岛素样生长因子‑1、碱性成纤维生长因子和基础培养基。

【技术特征摘要】
1.一种成骨诱导培养基，其特征在于，包括维生素C、地塞米松、β-甘油磷酸钠、胰岛素样生长因子-1、碱性成纤维生长因子和基础培养基。2.根据权利要求1所述的成骨诱导培养基，其特征在于，所述成骨诱导培养基中各组分的用量为：维生素C：10～100μg/L；地塞米松：(1～10)×10-8mol/L；β-甘油磷酸钠：1～20mol/L；胰岛素样生长因子-1：5～20μg/L；碱性成纤维生长因子：5～20μg/L；基础培养基：补足。3.根据权利要求1或2所述的成骨诱导培养基，其特征在于，所述成骨诱导培养基中各组分的用量为：维生素C：50μg/L；地塞米松：1×10-8mol/L；β-甘油磷酸钠：10mol/L；胰岛素样生长因子-1：5～20μg/L；碱性成纤维生长因子：5～20μg/L；基础培养基：补足。4.根据权利要求1至3中任一项所述的成骨诱导培养基，其特征在于，所述成骨诱导培养基中各组分的用量为：...

【专利技术属性】
技术研发人员：葛啸虎，陈海佳，王一飞，戚康艺，张维敏，
申请(专利权)人：广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44