一种水稻愈伤组织分化培养基及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种水稻愈伤组织分化培养基及其制备方法和应用，所述水稻愈伤组织分化培养基，是在MS基础培养基或J3基础培养基中添加KT、NAA和山梨醇；其中，所述KT、NAA和山梨醇在所述水稻愈伤组织分化培养基中的浓度分别为1-2mg/L、0.5-2mg/L和20-50g/L。本发明专利技术通过探索分化激素配比、温度条件以及添加不同碳源，筛选出一种高效的水稻愈伤组织分化培养基，可显著提高水稻愈伤组织分化率。

【技术实现步骤摘要】
一种水稻愈伤组织分化培养基及其制备方法和应用
本专利技术涉及一种水稻愈伤组织分化培养基及其制备方法和应用，属于水稻组织培养和转基因

技术介绍
植物组织培养技术由20世纪初发展起来，是指在无菌条件下，将离体的植物器官、组织、细胞、原生质体等在合适的条件进行离体培养，诱导产生愈伤组织、不定芽等，进一步形成完整植株的过程(王家麟(2006)植物组织培养及其应用研究概况.3:86-89)。组织培养技术因其具有可以利用各种人工培养条件控制细胞的生长、分化等优点，有力地推动了植物生理学、病理学、药学、生物化学、遗传学以及作物育种等学科的交叉发展，并广泛应用于农业、林业、园艺、工业、医药业等多个行业，产生巨大的经济效益和社会效益。归纳起来，组培技术有以下几个应用方面：1、苗木的离体快繁；2、培育脱毒苗；3、应用于植物育种如单倍体育种、原生质体融合、胚和胚乳的培养基转基因育种等；4、生产次生代谢产物如中药成分等；5、人工种子和种质保存(李聪聪，李艳提(2013)植物组织培养概论.20:142-144)；6、基因功能研究等。在合适的离体培养条件下，原来已经组织特异化的细胞，重新分裂形成具备全能性的细胞团，即愈伤组织，这一过程称为“脱分化”；经“脱分化”的全能细胞，重新形成根、芽以及输导系统等各种类型细胞的过程称为“分化”。脱分化和分化是植物组织培养的两个重要环节，对组织培养效率起着决定性影响。为了提高愈伤组织的分化率，研究人员对培养基和培养方法进行了改造和创新，并取得了一定进展。比如采用干燥处理，辐射处理，不同激素配比，添加不同碳源，添加铜、银等元素，添加脯氨酸，添加多效唑(MET)和添加活性炭等方法。干燥处理和辐射处理较费时，辐射处理方法还需要特定的仪器；添加铜、银等元素会造成额外的重金属污染等。总之上述的方法多且杂乱，且有些方法只是对某些特定品种有显著作用，并不适用于其他品种。因此，建立一个普适型的愈伤组织分化成苗系统，就显得尤为重要。本专利技术通过摸索和实践，进一步优化分化培养基配方，最终摸索出了一种高效的水稻愈伤组织分化培养基。该分化培养基对水稻单倍体和转基因研究及遗传育种等具有较强的实用价值，并对于水稻的基因功能研究有良好的推动作用。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种高效的水稻愈伤组织分化培养基。本专利技术通过探索分化激素配比、温度条件以及添加不同碳源，筛选出一种高效的水稻愈伤组织分化培养基，可显著提高水稻愈伤组织分化率。实现本专利技术目的技术方案如下：一种水稻愈伤组织分化培养基，是在MS基础培养基或J3基础培养基中添加KT(即激动素)、NAA(即α-萘乙酸)和山梨醇；其中，所述KT、NAA和山梨醇在所述水稻愈伤组织分化培养基中的浓度分别为1-2mg/L、0.5-2mg/L和20-50g/L。优选地，上述水稻愈伤组织分化培养基，其中，所述KT、NAA和山梨醇在所述水稻愈伤组织分化培养基中的浓度分别为2mg/L、0.5mg/L和40g/L。上述水稻愈伤组织分化培养基，还含有适量碳源；所述碳源包括蔗糖、麦芽糖、葡萄糖等；所述碳源优选为蔗糖，其中，所述蔗糖在所述水稻愈伤组织分化培养基中的浓度为20-50g/L；优选为30g/L。上述水稻愈伤组织分化培养基，还含有凝固剂。所述凝固剂包括植物凝固剂、动物凝固剂等，例如琼脂、Phytagel植物凝胶、明胶等；优选为Phytagel植物凝胶。其中，所述Phytagel植物凝胶在所述水稻愈伤组织分化培养基中的浓度为3-4g/L；优选为3g/L。Phytagel是从假单胞菌分泌而来的一种琼脂的替代物，又名Gelrite,GeuamGum等。可从市售获得，例如SIGMA公司。上述水稻愈伤组织分化培养基其pH值为5.8-6.0，优选为5.9。可用本领域常规pH值调节，例如氢氧化钾和盐酸。较佳地，上述水稻愈伤组织分化培养基，是在MS基础培养基或J3基础培养基中添加KT、NAA、山梨醇、蔗糖和Phytagel植物凝胶；其中，所述KT、NAA、山梨醇、蔗糖和Phytagel植物凝胶在所述水稻愈伤组织分化培养基中的浓度分别为2mg/L、0.5mg/L、40g/L、30g/L、3g/L；所述水稻愈伤组织分化培养基其pH值为5.9。本专利技术上述水稻愈伤组织分化培养基适用于粳稻愈伤组织分化和籼稻愈伤组织分化。本专利技术还研究发现，上述以MS为基础培养基的水稻愈伤组织分化培养基特别适用于粳稻愈伤组织分化；以J3为基础培养基的水稻愈伤组织分化培养基适用于籼稻愈伤组织分化。本专利技术所述MS基础培养基、J3基础培养基为本领域通用术语，可市售获得，也可自行配制，以下列出其具体配方。J3基础培养基与文献YJLin，QFZhang(2005)Optimisingthetissuecultureconditionsforhighefficiencytransformationofindicarice.23:540–547记载的相同。所述MS基础培养基由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质具体配方如下：所述J3基础培养基由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质具体配方如下：本专利技术还提供上述水稻愈伤组织分化培养基的制备方法，包括以下步骤：按配方将各组分添加到MS基础培养基或J3基础培养基中而制得。具体地，以配置1L上述水稻愈伤组织分化培养基为例，其制备方法包括：取MS或J3大量(10X)100ml，MS或J3微量(100X)10ml，MS或J3有机(100X)10ml，MS或J3铁盐(100X)10ml混合后按配方加入蔗糖和山梨醇，完全溶解后调节至所需pH值(例如pH5.8-6.0)，得混合液。按配方称取Phytagel植物凝胶溶于800ml去离子水，置于微波炉中煮沸至完全溶解，加入上述混合液中定容到1L，116℃灭菌15min；灭菌后待其冷却至50℃左右加KT、NAA至所需浓度，摇匀，即得。可分装至三角瓶，45mL/瓶；分装至平皿25ml/9cm平皿。本专利技术还提供上述水稻愈伤组织分化培养基在水稻组织培养及基因转化中的应用；所述水稻包括粳稻和籼稻。本专利技术还提供一种诱导水稻愈伤组织分化的方法，包括以下步骤：取水稻愈伤组织或胚性愈伤组织置于上述水稻愈伤组织分化培养基上培养诱导分化为绿苗；优选地，上述培养诱导条件为温度26-30℃，光照培养，培养周期25-40d。优选地，所述水稻愈伤组织或胚性愈伤组织由水稻成熟种子、未成熟种子、幼胚、幼穗、花药等外植体诱导获得。优选地，所述水稻为粳稻或籼稻，进一步优选为粳稻ZH11或籼稻9311。采用本专利技术水稻愈伤组织分化培养基，分化条件容易控制；经测试，在上述分化条件下愈伤组织分化出现绿点时间快且出现绿点数多即分化率高。本专利技术通过研究不同激素配比、不同碳源的添加以及不同培养条件，从而显著提高水稻愈伤组织绿苗分化率，并有助于提高基因转化效率或组培成苗率。与已有技术相比，本专利技术的优点在于：1、本专利技术分化激素只用到KT和NAA，不需要添加其他激素和有机物就可以实现高分化率，简单方便，节约成本。2、在培养基内添加20-50g/L的山梨醇，使愈伤组织保持良好的状态，抑制愈伤组织褐化，提高分化率和组培成苗率或转基因效率。3、本专利技术培养条件为26-30℃，光照培养，在该条件下分化，出苗快且长势好。本专利技术所述的培养基本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种水稻愈伤组织分化培养基，其特征在于，是在MS基础培养基或J3基础培养基中添加KT、NAA和山梨醇；其中，所述KT、NAA和山梨醇在所述水稻愈伤组织分化培养基中的浓度分别为1‑2mg/L、0.5‑2mg/L和20‑50g/L。

【技术特征摘要】
1.一种水稻愈伤组织分化培养基，其特征在于，是在MS基础培养基或J3基础培养基中添加KT、NAA和山梨醇；其中，所述KT、NAA和山梨醇在所述水稻愈伤组织分化培养基中的浓度分别为2mg/L、0.5-1.5mg/L和20-50g/L；所述水稻愈伤组织分化培养基还含有蔗糖，其中，所述蔗糖在所述水稻愈伤组织分化培养基中的浓度为20-50g/L。2.根据权利要求1所述的水稻愈伤组织分化培养基，其特征在于，所述KT、NAA和山梨醇在所述水稻愈伤组织分化培养基中的浓度分别为2mg/L、0.5mg/L和40g/L；或者所述KT、NAA和山梨醇在所述水稻愈伤组织分化培养基中的浓度分别为2mg/L、1mg/L和40g/L；或者所述KT、NAA和山梨醇在所述水稻愈伤组织分化培养基中的浓度分别为2mg/L、1.5mg/L和40g/L。3.根据权利要求1或2所述的水稻愈伤组织分化培养基，其特征在于，所述蔗糖在所述水稻愈伤组织分化培养基中的浓度为30g/L。4.根据权利要求1或2所述的水稻愈伤组织分化培养基，其特征在于，所述水稻愈伤组织分化培养基还含有凝固剂，所述凝固剂包括植物凝固剂、动物凝固剂。5.根据权利要求4所述的水稻愈...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄培劲，安保光，陈思兰，李亚梅，
申请(专利权)人：海南波莲水稻基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：海南;66