本发明专利技术公开了一种虎杖愈伤组织低温处理植株技术，即以虎杖种子诱导得到的愈伤组织为材料建立了虎杖离体超低温保存技术体系，从而有效地保护了虎杖优良种质资源。本发明专利技术经过愈伤组织诱导、预培养、装载、脱水、冷冻、洗涤、再培养及再生等过程实现了虎杖愈伤组织超低温保存，可作为一种长期稳定保存种质资源的方法，降低保存经济成本，有效地保护了珍稀种质资源。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及到虎杖植物
，尤其是一种虎杖愈伤组织低温处理植株技术。
技术介绍
虎杖为蓼科植物，虎杖（PoLygonumcuspidatumSieb.etzuce）干燥根茎及根。主产江苏、浙江、广东、广西、四川、贵州。春秋季采挖，除去残茎及须根，洗净泥土，切段成切片，晒干。根茎或根呈圆粒形段块片，有分支，稍弯曲，长短不一。外表面棕褐色，有明显纵皱纹，须根和总状须根痕。质坚硬，折断面棕黄色，纤维性。断面皮部薄，棕褐色。主要成份：含蒽西昆类衍生物，并以游离型为主，其中有大黄素，大黄素甲醚，大黄酚等。还含有大黄素-8-葡萄糖苷，大黄素甲醚-8-葡萄糖苷，还含有茂三酚、茂三酚苷、多聚糖、缩合鞣质等。功用主治：活血去瘀，利湿退黄，清热解毒，止咳化痰。用于瘀血闭经，痛经，关节肿痛，跌打损伤，湿热黄疸，带下，毒蛇咬伤，外用的制成油膏等。随着生物技术的发展，超低温保存植物愈伤组织技术已日趋完善，愈伤组织用液氮超低温保存后，其生理代谢、分化能力下降和基因特异性丧失等问题可得到控制，可以作为一种长期稳定保存种质资源和工业化，免去了不必要的人力、物力、财物浪费。以超低温冷冻方法保存的愈伤组织可在其后很长时间里根据人们的需要将其取出并用于生产，从而有效地保护了珍稀植物的种质资源。至今为止，尚未见有关虎杖愈伤组织超低温保的报道，这严重制约了虎杖种质资源的保存。因此，非常有必要建立虎杖离体超低温保存技术体系，为科学研究提供了极大帮助。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种虎杖愈伤组织低温处理植株技术，本专利技术经过愈伤组织诱导、预培养、装载、脱水、冷冻、洗涤、再培养及再生等过程实现了虎杖愈伤组织超低温保存，从而实现本专利技术的目的。本专利技术的技术解决方案是这样的，一种虎杖愈伤组织低温处理植株技术，其特征在于包括以下工艺步骤：（1）外植体的处理：选取当年收饱满的虎杖种子，以洗洁精水刷洗，置于自来水中冲洗32min后置于清水中浸泡13h，再转入125mg/mL的赤霉素溶液中浸泡16h，然后在超净工作台中以75%乙醇溶液浸泡32s，无菌水冲洗6次，再用含有0.06%吐温-20的0.6%升汞溶液消毒11min，无菌水冲洗6次后用无菌滤纸吸干表面的水分后备用；（2）愈伤组织诱导：用无菌解剖刀在经步骤（1）处理后的种子上割刀造成伤口后接种到诱导培养基上进行愈伤组织诱导培养，接种后在26℃条件下进行全暗培养直至形成愈伤组织；（3）预培养：将步骤（2）得到的长势良好的愈伤组织转接至预培养基中进行预培养，接种后在6℃条件下培养6天后检测细胞存活率；（4）装载处理：将经步骤（3）处理后存活的愈伤组织切成2cm左右大小，放入12mL冷冻管后加62%玻璃化保护剂PVS2在室温下装载处理42min；（5）脱水及冷冻：将经步骤（4）处理后的愈伤组织转至预冷至1℃的100%的玻璃化保护剂PVS2中在6℃处理62min后将冷冻管投入液氮中冷冻处理；（6）化冻及洗涤：愈伤组织在液氮中保存26h后，取出冷冻管，在42℃水浴中化冻，化冻过程中不断振荡冷冻管，使管内愈伤组织和保护剂受热均匀,然后用含1.2mol/L的MS培养液在室温下洗涤6次，每次12min；（7）再培养：将经化冻后的愈伤组织用无菌水冲洗9次后立即转移至继代培养基中进行增殖培养。接种后先在29℃条件下全暗培养22天，然后每天光照18小时，光照强度为3200lx，培养温度为29℃的条件下培养；（8）芽诱导：将步骤（7）培养至22天的长势良好的愈伤组织转接至分化培养基中进行不定芽诱导，接种后先在29℃条件下全暗培养6天，然后每天光照18小时，光照强度为1800lx，培养温度为29℃的条件下培养直至形成不定芽；（9）生根培养：当丛生芽长至3.6cm高时，将丛生苗切割成单苗接种至生根培养基中进行生根培养，接种后先在29℃条件下全暗培养5天，然后每天光照18小时，光照强度为1800lx，培养温度为29℃的条件下培养直至长出根；（10）试管苗移栽：当小苗长出的新根系长达3.6cm，并且长出侧根，苗高6cm以上时，将培养瓶瓶盖打开并置于自然光照下炼苗8天后，将试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，尽量不伤害根部，栽入由黄沙土和火碳泥（1：1）混合成的基质并定植于大田中。步骤（2）所述的诱导培养基为：MS+6mg/L2,4-D+2.5mg/L6-BA+1.5mg/LKT+3.8%蔗糖+0.6%琼脂+0.2%活性炭，pH值为5.9。步骤（3）所述的预培养基为：MS+3.5mg/L6-BA+3.2mg/LNAA+5.5%DMSO+3.6%蔗糖+0.55%琼脂+0.2%活性炭，pH值为5.9。步骤（4）所述的玻璃化保护剂PVS2为：32%甘油+16%乙二醇+16%DMSO+0.5mol/L的蔗糖。步骤（5）所述的继代培养基为：MS+3.2mg/L6-BA+1.2mg/LNAA+3.6%蔗糖+0.6%琼脂+0.2%活性炭，pH值为5.9。步骤（8）所述的分化培养基为：MS+0.6mg/LNAA+2.5mg/L6-BA+3.6%蔗糖+0.55%琼脂+0.2%活性炭，pH值为5.9。步骤（9）所述的生根培养基为：1/2MS+0.6mg/L6-BA+1.2mg/LNAA+2.6%蔗糖+0.65%琼脂+0.2%活性炭，pH值为5.9。本专利技术的优点是:以虎杖种子诱导得到的愈伤组织为材料建立了虎杖离体低温保存技术体系，从而有效地保护了虎杖优良种质资源。本专利技术经过愈伤组织诱导、预培养、装载、脱水、冷冻、洗涤、再培养及再生等过程实现了虎杖愈伤组织超低温保存，可作为一种长期稳定保存种质资源的方法，降低保存经济成本，有效地保护了珍稀的种质资源。具体实施方式下面实施例是对本专利技术的进一步说明。实施例：（1）外植体的处理：选取当年收饱满的虎杖种子，以洗洁精水轻轻刷洗，自来水冲洗12min后清水中浸泡9h，再转入52mg/mL的赤霉素溶液中浸泡12h，然后在超净工作台中以75%乙醇溶液浸泡12s，无菌水冲洗5次，再用含有0.01%吐温-20的0.1%升汞溶液消毒6min，无菌水冲洗4次后用无菌滤纸吸干表面的水分后备用。（2）愈伤组织诱导：用无菌解剖刀在经步骤（1）处理后的种子上割刀造成伤口后接种到诱导培养基上进行愈伤组织诱导培养，接种后在26℃条件下进行全暗培养直至形成愈伤组织。所述的诱导培养基为：MS+5mg/L2,4-D+2mg/L6-BA+0.6mg/LKT+3.0%蔗糖+0.6%琼脂+0.06%活性炭，pH值为5.9。（3）预培养：将步骤（2）得到的4周龄的长势良好的愈伤组织转接至预培养基中进行预培养，接种后在1℃条件下培养2天后检测细胞存活率。所述的预培养基为：MS+1.2mg/L6-BA+1.2mg/LNAA+1.2%DMSO+2.25%蔗糖+0.35%琼脂+0.2%活性炭，pH值为5.9。（4）装载处理：将经步骤（3）处理后存活的愈伤组织切成2cm左右大小，放入12mL冷冻管后加55%玻璃化保护剂PVS2在室温下装载处理22min。所述的玻璃化保护剂PVS2为：32%甘油+16%乙二醇+16%DMSO+0.5mol/L的蔗糖。（5）脱水及冷冻：将经步骤（4）处理后的愈伤组织转至预冷至1℃的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种虎杖愈伤组织低温处理植株技术，其特征在于包括以下工艺步骤：步骤 （1）外植体的处理：选取当年收饱满的虎杖种子，以洗洁精水刷洗，置于自来水中冲洗32min后置于清水中浸泡13h，再转入125mg/mL的赤霉素溶液中浸泡16h，然后在超净工作台中以75%乙醇溶液浸泡32s，无菌水冲洗6次，再用含有0.06%吐温‑20的0.6%升汞溶液消毒11min，无菌水冲洗6次后用无菌滤纸吸干表面的水分后备用；步骤（2）愈伤组织诱导：用无菌解剖刀在经步骤（1）处理后的种子上割刀造成伤口后接种到诱导培养基上进行愈伤组织诱导培养，接种后在26℃条件下进行全暗培养直至形成愈伤组织；步骤（3）预培养：将步骤（2）得到的长势良好的愈伤组织转接至预培养基中进行预培养，接种后在6℃条件下培养6天后检测细胞存活率；步骤（4）装载处理：将经步骤（3）处理后存活的愈伤组织切成2cm左右大小，放入12mL冷冻管后加62%玻璃化保护剂PVS2在室温下装载处理42min；步骤（5）脱水及冷冻：将经步骤（4）处理后的愈伤组织转至预冷至1℃的100%的玻璃化保护剂PVS2中在6℃处理62min后将冷冻管投入液氮中冷冻处理；步骤（6）化冻及洗涤：愈伤组织在液氮中保存26h后，取出冷冻管，在42℃水浴中化冻，化冻过程中不断振荡冷冻管，使管内愈伤组织和保护剂受热均匀,然后用含1.2mol/L的MS培养液在室温下洗涤6次，每次12min；步骤（7）再培养：将经化冻后的愈伤组织用无菌水冲洗9次后立即转移至继代培养基中进行增殖培养，接种后先在29℃条件下全暗培养22天，然后每天光照18小时，光照强度为3200lx，培养温度为29℃的条件下培养；步骤（8）芽诱导：将步骤（7）培养至22天的长势良好的愈伤组织转接至分化培养基中进行不定芽诱导，接种后先在29℃条件下全暗培养6天，然后每天光照18小时，光照强度为1800lx，培养温度为29℃的条件下培养直至形成不定芽；步骤（9）生根培养：当丛生芽长至3.6cm高时，将丛生苗切割成单苗接种至生根培养基中进行生根培养，接种后先在29℃条件下全暗培养5天，然后每天光照18小时，光照强度为1800lx，培养温度为29℃的条件下培养直至长出根；步骤（10）试管苗移栽：当小苗长出的新根系长达3.6cm，并且长出侧根，苗高6cm以上时，将培养瓶瓶盖打开并置于自然光照下炼苗8天后，将试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，尽量不伤害根部，栽入由黄沙土和火碳泥（1：1）混合成的基质并定植于大田中。...
【技术特征摘要】
1.一种虎杖愈伤组织低温处理植株技术，其特征在于包括以下工艺步骤：步骤（1）外植体的处理：选取当年收饱满的虎杖种子，以洗洁精水刷洗，置于自来水中冲洗32min后置于清水中浸泡13h，再转入125mg/mL的赤霉素溶液中浸泡16h，然后在超净工作台中以75%乙醇溶液浸泡32s，无菌水冲洗6次，再用含有0.06%吐温-20的0.6%升汞溶液消毒11min，无菌水冲洗6次后用无菌滤纸吸干表面的水分后备用；步骤（2）愈伤组织诱导：用无菌解剖刀在经步骤（1）处理后的种子上割刀造成伤口后接种到诱导培养基上进行愈伤组织诱导培养，接种后在26℃条件下进行全暗培养直至形成愈伤组织；步骤（3）预培养：将步骤（2）得到的长势良好的愈伤组织转接至预培养基中进行预培养，接种后在6℃条件下培养6天后检测细胞存活率；步骤（4）装载处理：将经步骤（3）处理后存活的愈伤组织切成2cm左右大小，放入12mL冷冻管后加62%玻璃化保护剂PVS2在室温下装载处理42min；步骤（5）脱水及冷冻：将经步骤（4）处理后的愈伤组织转至预冷至1℃的100%的玻璃化保护剂PVS2中在6℃处理62min后将冷冻管投入液氮中冷冻处理；步骤（6）化冻及洗涤：愈伤组织在液氮中保存26h后，取出冷冻管，在42℃水浴中化冻，化冻过程中不断振荡冷冻管，使管内愈伤组织和保护剂受热均匀,然后用含1.2mol/L的MS培养液在室温下洗涤6次，每次12min；步骤（7）再培养：将经化冻后的愈伤组织用无菌水冲洗9次后立即转移至继代培养基中进行增殖培养，接种后先在29℃条件下全暗培养22天，然后每天光照18小时，光照强度为3200lx，培养温度为29℃的条件下培养；步骤（8）芽诱导：将步骤（7）培养至22天的长势良好的愈伤组织转接至分化培养基中进行不定芽诱导，接种后先在29℃条件下全暗培养6天，然后每天光照18小时，光照强度为1800lx，培养温度为29℃的条件下培养直至形成不定芽；步骤（9）生根培养：当丛生芽长至3.6cm高时，将丛生苗切割成...
【专利技术属性】
技术研发人员：李志勇，
申请(专利权)人：李志勇，
类型：发明
国别省市：广西;45
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。