一种快速高效的白桦转基因方法技术

一种快速高效的白桦转基因方法，它涉及一种植物转基因的方法。本发明专利技术的目的是要解决现有白桦稳定转化效率低和转化周期太长的问题。本发明专利技术的方案为：选取苗高为5～6cm的白桦组培苗，诱导培养愈伤组织；转移至含目的基因序列的根癌农杆菌侵染液中，抽真空处理后，暗培养；进行抗性苗筛选，将筛选的抗性苗转移到加选择剂和抑菌剂的生根培养基中培养，分子检测验证成功后，即完成。与现有技术相比，平均转化率提高了2.71倍。且用愈伤组织侵染转化周期比用叶片和茎为外植体转化周期缩短1/3以上。本发明专利技术应用转基因领域。

A fast and efficient method for Transgenic Birch

The invention relates to a fast and efficient birch transgene method, which relates to a transgenic method of plants. The aim of the invention is to solve the problems of low stable conversion efficiency and long conversion cycle of the existing birch. The scheme of the invention is as follows: select the seedling height of 5 ~ 6cm of birch seedlings, callus; transferred to Agrobacterium infection solution containing the gene sequence in the vacuum treatment after dark culture; the resistance seedling screening, the screening of the resistant plantlets were transferred to selective agents and antibacterial agents the rooting medium, molecular detection after successful verification, is completed. Compared with the prior art, the average conversion rate is increased by 2.71 times. The cycle of callus infection and transformation was shorter than that of leaves and stems, and the conversion period was over 1/3. The invention applies transgenic field.

【技术实现步骤摘要】
一种快速高效的白桦转基因方法
本专利技术涉及一种植物转基因的方法。
技术介绍
白桦(Betulaplatyphylla)是桦木属(BetulaLinn)的一种落叶乔木。在亚洲东部广布分布。喜光，耐严寒，生命力极强，是恢复植被、保护森林水分和土壤的优良造林树种，同时又是一个重要的药用和纤维用优良经济树种。但白桦传统育种周期长，遗传改良进程缓慢，不能按照育种目标改造性状来满足日益增长的社会需要。而基因工程育种技术中，现有的白桦转基因主要是对外植体直接进行转化，由于白桦再生与转化所用外植体具组织特异性、转化周期漫长等常导致其转化效率较低。此外，这些转化技术通常因为农杆菌的长期参与造成受体材料黄化严重，再生困难，这些成为制约白桦分子育种进程的“瓶颈”所在。所以寻找一种快速、稳定、高效的遗传转化方法对白桦基因功能研究和遗传改良至关重要。本实验的创新之处一是在白桦愈伤的基础上进行的农杆菌侵染转化，这样避免了直接使用外植体带来的转化时间长，转化效率低的困扰。白桦外植体直接进行转化途径中从侵染的外植体到获得抗性芽需要2-3个月，使用白桦愈伤进行转化从外植体到获得抗性芽需要1个月左右，大大缩短了转化时间。二是增加了负压(抽真空)处理的步骤，负压处理能能提高白桦稳定转化效率。本专利技术创造性的使用白桦愈伤与首次在白桦中使用真空抽提技术相结合大大促进了白桦稳定转化的效率。故优化后的白桦稳定转化体系能很大程度上提高转基因效率，缩短转基因时间。
技术实现思路
本专利技术是要解决现有白桦稳定转化效率低和转化周期太长的问题，为快速研究白桦基因功能、获得目标性状改良的转基因植株提供平台。白桦遗传转化是对原有的白桦转化体系的完善。本专利技术的一种快速高效的白桦转基因方法，它是按照以下步骤进行的：一、选取苗高为5～6cm的白桦组培苗，在超净工作台中将外植体叶片和茎段置于愈伤诱导培养基中，诱导培养7～10天；二、将步骤一在愈伤诱导培养基中生长的愈伤组织取出，转移至含目的基因序列的根癌农杆菌侵染液中，用真空泵中抽真空5～10min后，置于共培养的培养基上，黑暗处理48h；其中，侵染液OD600为0.6～0.8，三、将步骤二黑暗处理后的愈伤组织置于加入抑菌剂的转基因抗性筛选培养基上于25℃光照条件下进行筛选培养40～50天，得到白桦抗性苗；四、将步骤三的白桦抗性苗转移到加选择剂和抑菌剂的生根培养基中培养37-42天后，进行分子检测验证，检测验证正确后，即表明获得转基因白桦苗。本专利技术的有益效果：本专利技术的方法通过选择适宜生理状态的白桦组培苗进行了诱导愈伤处理。这种处理方式避免了白桦外植体直接转化的周期长及白桦外植体的选择困难等问题。(注：选择的白桦叶片过于幼嫩容易被农杆菌侵染，需要每天或隔天对叶片进行除菌，这种过于幼嫩的叶片很容易被菌包裹而死，不易获得转化后的抗性苗。选择的白桦叶片过于衰老虽不易被农杆菌侵染，但是叶片分化愈伤组织能力差，也不易获得转化成功的抗性苗。白桦的茎段也存在类似叶片的问题，但茎段最主要的问题是茎段带有芽点，会导致大量的假阳性苗产生，转化效率低。在白桦愈伤组织的基础上应用真空泵抽真空5-10min的处理。该处理能使含目的基因的侵染液和受体白桦的愈伤组织充分接触，能大大提高转化效率。在以上因素的共同作用下能提高白桦稳定转化效率。本专利技术在筛选和除菌的培养基上转移5次，共获得了19棵抗性芽，转化率为9.5％，与侵染白桦叶片相比，平均转化率提高了4.75倍；与直接侵染白桦外植体-茎段相比，平均转化率提高了3.8倍，与侵染白桦愈伤相比，平均转化率提高了2.71倍。且用愈伤组织侵染转化周期比用叶片和茎为外植体转化周期缩短1/3以上。附图说明图1为实施例一中继代培养的白桦组培苗照片；图2为实施例一中继代培养40天的白桦组培苗照片；图3为实施例一中愈伤诱导培养基诱导后的愈伤组织照片；图4为实施例一中愈伤诱导培养基诱导后的愈伤组织照片；图5为实施例一中愈伤被目的基因侵染后筛选培养基上长出的白桦早期抗性不定芽照片；图6为实施例一中愈伤组织在被目的基因侵染后筛选培养基上长出的白桦抗性不定芽丛生苗照片；图7为实施例一中的加抗生素的生根培养基上的白桦抗性苗照片。具体实施方式具体实施方式一：本实施方式的一种快速高效的白桦转基因方法，它是按照以下步骤进行的：一、选取苗高为5～6cm的白桦组培苗，在超净工作台中将外植体叶片和茎段置于愈伤诱导培养基中，诱导培养7～10天；二、将步骤一在愈伤诱导培养基中生长的愈伤组织取出，转移至含目的基因序列的根癌农杆菌侵染液中，用真空泵中抽真空5～10min后，置于共培养的培养基上，黑暗处理48h；其中，侵染液OD600为0.6～0.8，三、将步骤二黑暗处理后的愈伤组织置于加入抑菌剂的转基因抗性筛选培养基上于25℃光照条件下进行筛选培养40～50天，得到白桦抗性苗；四、将步骤三的白桦抗性苗转移到加选择剂和抑菌剂的生根培养基中培养37-42天后，进行分子检测验证，检测验证正确后，即表明获得转基因白桦苗。具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中所述的生根培养基含WPM(WoodyPlantmedium)、0.2mg/L的NAA(1-naphthylaceticacid)、30g/L的蔗糖和3.0mg/LPhytagel(结冷胶)，pH＝5.8。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中所述的愈伤诱导培养基含WPM(WoodyPlantmedium)、0.8mg/L的6-BA(6-benzyladenine)、0.5mg/L的GA3(GibberellicacidA3)、0.02mg/L的NAA(1-naphthylaceticacid)、30g/L的蔗糖和3.0mg/L的Phytagel(结冷胶)，pH＝5.8。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤二中所述的共培养的培养基含WPM(WoodyPlantmedium)、1.0mg/L的6-BA(6-benzyladenine)、30g/L的蔗糖和3.0mg/L的Phytagel(结冷胶)，pH＝5.8。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤二中所述的侵染液含WPM(WoodyPlantmedium)、150μM的As(乙酰丁香酮，Acetosyringone)、30g/L的蔗糖，pH＝5.8。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤三中所述的筛选培养基含WPM(WoodyPlantmedium)、1.0mg/L的6-BA(6-benzyladenine)、30g/L的蔗糖、3.0mg/L的Phytagel(结冷胶)，选择剂和抑制剂，pH＝5.8。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式六不同的是：选择剂为30～50mg/L的卡那霉素，抑制剂为300～500mg/L的氨苄霉素。其它与具体实施方式六相同。具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤四中所述的生根培养基含WPM(WoodyPlantmedium)、0.2mg/L的NAA(1-naphthylacet本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速高效的白桦转基因方法，其特征在于它是按照以下步骤进行的：一、选取苗高为5～6cm的白桦组培苗，在超净工作台中将外植体叶片和茎段置于愈伤诱导培养基中，诱导培养7～10天；二、将步骤一在愈伤诱导培养基中生长的愈伤组织取出，转移至含目的基因序列的根癌农杆菌侵染液中，用真空泵中抽真空5～10min后，置于共培养的培养基上，黑暗处理48h；其中，侵染液OD

【技术特征摘要】
1.一种快速高效的白桦转基因方法，其特征在于它是按照以下步骤进行的：一、选取苗高为5～6cm的白桦组培苗，在超净工作台中将外植体叶片和茎段置于愈伤诱导培养基中，诱导培养7～10天；二、将步骤一在愈伤诱导培养基中生长的愈伤组织取出，转移至含目的基因序列的根癌农杆菌侵染液中，用真空泵中抽真空5～10min后，置于共培养的培养基上，黑暗处理48h；其中，侵染液OD600为0.6～0.8，三、将步骤二黑暗处理后的愈伤组织置于加入抑菌剂的转基因抗性筛选培养基上于25℃光照条件下进行筛选培养40～50天，得到白桦抗性苗；四、将步骤三的白桦抗性苗转移到加选择剂和抑菌剂的生根培养基中培养37～42天后，进行分子检测验证，检测验证正确后，即表明获得转基因白桦苗。2.根据权利要求1所述的一种快速高效的白桦转基因方法，其特征在于步骤一中所述的生根培养基含WPM、0.2mg/L的NAA、30g/L的蔗糖和3.0mg/LPhytagel，pH＝5.8。3.根据权利要求1所述的一种快速高效的白桦转基因方法，其特征在于步骤一中所述的愈伤诱导培养基含WPM、0.8mg/L的6-BA、0.5mg/L的GA3、0.02mg/L的NAA、30g/L的蔗糖和3.0mg/L的Phytagel，pH＝5.8。4.根据权利要求1所述的一种快速...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘中原，高彩球，王玉成，张腾倩，王培龙，唐绯绯，李亚博，王媛媛，
申请(专利权)人：东北林业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23