本发明专利技术公开了愈伤组织起始发育相关蛋白GaLBD-2及其相关生物材料与应用。本发明专利技术所提供的愈伤组织起始发育相关蛋白GaLBD-2为a)或b)或c)：a)氨基酸序列是SEQ ID No.2所示的蛋白质；b)在SEQ ID No.2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；c)将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与愈伤组织起始发育相关的蛋白质。实验证明，愈伤组织起始发育相关蛋白GaLBD-2可诱导植物愈伤组织起始，从而替代抗生素作为植物转基因的筛选标记，为无抗生素基因的植物转基因育种奠定基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
中愈伤组织起始发育相关蛋白GaLBD-2及其相关生物材料与应用。
技术介绍
植物的遗传转化体系必须有一个有效的转化筛选标记系统。目前转基因研究中被广泛应用的转化细胞筛选标记系统主要有两类：一类是将抗性基因作为选择标记，将非转化细胞杀死而使转化细胞存活的负向筛选系统，主要包括两种，一种是编码使抗生素失活的蛋白酶基因如新霉素磷酸转移酶基因nptII和潮霉素磷酸转移酶基因hpt等，另一种是可使除草剂失活的基因如膦丝菌素乙酰转移酶基因bar和5-烯醇丙酮酰草莽酸-3-磷酸合成酶基因epsps。这两种方法都是通过将外源的筛选标记基因转入受体细胞中，在培养基中添加筛选物质，不仅增加了培养成本，使用过的培养基增加了环境中的抗生素、除草剂等筛选物质的残留量。同时完成筛选作用后，这些抗性基因便失去了作用，成为转基因植物的一种负担。由于标记基因数量有限，这些基因的存在给转基因植物的再次转化带来了困难，无法将多种优良性状积累到同一转化植株内从而得到产量、品质等多种性状同步改善的作物。另一类则是无抗生素和除草剂抗性，基因及其编码的蛋白对生态环境和生物无毒无抗性，相对安全，被称为区别于传统抗性标记基因的新一代标记基因。安全标记基因策略不是依靠对非转化细胞致死作用筛选出转化细胞，而是将转化细胞处于某种有利的环境，从而筛选出转化细胞。这种方法的优点在于选择剂无毒副作用，操作简单，在多数情况下有利于转化植株的再生。新一代标记基因主要为编码激素、抗逆、糖类、氨基酸、叶绿体和解毒等代谢系统的酶类基因。其中，愈伤组织起始发育基因通过调节植物内源生长素信号转导，使转化细胞的生长与分化不同于非转化细胞，从而有效筛选出转化细胞和植株，具有不需要在培养基中添加任何筛选标记的优势。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是如何建立无抗生素和除草剂抗性的植物遗传转化正向筛选体系。为解决上述技术问题，本专利技术首先提供了名称为GaLBD-2的蛋白质。本专利技术所提供的蛋白质GaLBD-2，来源于亚洲棉(Gossypium arboreum L.)，为如下a)或b)或c)的蛋白质：a)氨基酸序列是SEQ ID No.2所示的蛋白质；b)在SEQ ID No.2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；c)将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与愈伤组织起始发育相关的蛋白质。其中，SEQ ID No.2由201个氨基酸组成。为了使a)中的蛋白质便于纯化，可在SEQ ID No.2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1、标签的序列标签残基序列Poly-Arg5-6(通常为5个)RRRRRPoly-His2-10(通常为6个)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tag II8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL上述c)中的蛋白质GaLBD-2，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。上述c)中的蛋白质GaLBD-2可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述c)中的蛋白质GaLBD-2的编码基因可通过将SEQ ID No.1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。为解决上述技术问题，本专利技术还提供了与所述GaLBD-2相关的生物材料。本专利技术所提供的与GaLBD-2相关的生物材料，为下述A1)至A20)中的任一种：A1)编码所述GaLBD-2的核酸分子；A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系；A13)含有A1)所述核酸分子的转基因植物组织；A14)含有A2)所述表达盒的转基因植物组织；A15)含有A3)所述重组载体的转基因植物组织；A16)含有A4)所述重组载体的转基因植物组织；A17)含有A1)所述核酸分子的转基因植物器官；A18)含有A2)所述表达盒的转基因植物器官；A19)含有A3)所述重组载体的转基因植物器官；A20)含有A4)所述重组载体的转基因植物器官。上述生物材料中，A1)所述核酸分子为如下a1)或a2)或a3)所示的基因：a1)其编码序列是SEQ ID No.1的cDNA分子或DNA分子；a2)与a1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码氨基酸序列为SEQ ID No.2的蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；a3)在严格条件下与a1)或a2)限定的核苷酸序列杂交，且编码氨基酸序列为SEQ ID No.2的蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。其中，SEQ ID No.1由606个核苷酸组成，SEQ ID No.1的核苷酸编码SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本专利技术的编码GaLBD-2的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本专利技术分离得到的GaLBD-2的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码GaLBD-2且具有GaLBD-2功能，均是衍生于本专利技术的核苷酸序列并且等同于本专利技术的序列。这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本专利技术的编码SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。上述生物材料中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。上述生物材料中，A2)所述的含有编码GaLBD-2的核酸分子的表达盒(GaLBD-2基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达GaLBD-2的DNA，该DNA不但可包括启动GaLBD-2基因转录的启动子，还可包括终止GaLBD-2基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本专利技术的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官本文档来自技高网...
【技术保护点】
如下a)或b)或c)的蛋白质：a)氨基酸序列是SEQ ID No.2所示的蛋白质；b)在SEQ ID No.2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；c)将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与愈伤组织起始发育相关的蛋白质。
【技术特征摘要】
1.如下a)或b)或c)的蛋白质：a)氨基酸序列是SEQ ID No.2所示的蛋白质；b)在SEQ ID No.2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；c)将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与愈伤组织起始发育相关的蛋白质。2.与权利要求1所述蛋白质相关的生物材料，为下述A1)至A20)中的任一种：A1)编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子；A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系；A13)含有A1)所述核酸分子的转基因植物组织；A14)含有A2)所述表达盒的转基因植物组织；A15)含有A3)所述重组载体的转基因植物组织；A16)含有A4)所述重组载体的转基因植物组织；A17)含有A1)所述核酸分子的转基因植物器官；A18)含有A2)所述表达盒的转基因植物器官；A19)含有A3)所述重组载体的转基因植物器官；A20)含有A4)所述重组载体的转基因植物器官。3.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于：A1)所述核酸分子为如下a1)或a2)或a3)所示的基因：a1)其编码序列是SEQ ID No.1的cDNA分子或DNA分子；a2)与a1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1所述愈伤组织起始发育相关蛋白的cDNA分子或基因组DNA分子；a3)在严格条件下与a1)或a2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1所述愈伤组织起始发育相关蛋白的cDNA分子或基因组DNA分子...
【专利技术属性】
技术研发人员：李付广，王晔，张朝军，王倩华，郑武，
申请(专利权)人：中国农业科学院棉花研究所，
类型：发明
国别省市：河南;41
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