一种耐镉芦苇幼苗的人工种子的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种耐镉芦苇幼苗的人工种子的制备方法，其特征在于以芦苇种子为外植体；消毒后置于诱导培养基上诱导出胚性愈伤组织；然后获取胚性培养物生成完整植株；得到再生芦苇苗；将芦苇再生苗转至无菌组培瓶中加入OECD模拟废水、活性污泥孵育，取根组织消毒研磨，再将浆稀释涂布于MS平板上培养，收集菌体，清洗后制成细菌重悬液，取芦苇胚性培养物浸入细菌重悬液中孵育，再将芦苇胚性培养物进行培养。配制溶胶悬液和CaCl

Method for preparing artificial seeds of cadmium tolerant reed seedling

The invention discloses a preparation method of artificial seeds of reed seedling tolerance to cadmium, characterized by reed seeds as explants; after disinfection in the induction medium to induce embryogenic callus; then obtaining embryogenic cultures generate complete plant regeneration; reed seedling; Plantlet in vitro to the reed flask activated sludge OECD wastewater, incubation, take root tissue disinfection grinding, and then coated on the plasma dilution on MS agar, collect the bacteria, after cleaning bacteria made heavy suspension from reed embryogenic cultures of bacteria in heavy suspension incubation, then reed embryogenic cultures were cultured. Sol suspension and CaCl were prepared

【技术实现步骤摘要】
一种耐镉芦苇幼苗的人工种子的制备方法
本专利技术涉及无性繁殖领域，具体为一种耐镉芦苇幼苗的人工种子的制备。
技术介绍
芦苇是广泛分布于世界各地、形态上高度分化的草甸与湿地植被建群种，具有重要的生态学和经济学价值。芦苇在自然环境中以根状茎繁殖为主，难以进行种子繁殖。长期大量的分株繁殖常常会导致种性的退化，从而影响植物的生活力。同时由于人类活动对生态环境的严重干扰，部分湿地重金属污染程度不容乐观。长期处于重金属污染环境中，植物的根茎存活和繁殖往往受到抑制，而导致种群衰退。所以，避免从芦苇原生地采取芦苇而保护原生地生态环境的同时，又如何轻便、快速培育具有重金属耐受性的幼苗，成为恢复芦苇种群研究的瓶颈。植物可通过有性的和无性的两个生命发育周期来繁殖，对于很难以种子进行有性繁殖的植物种，由微胶囊包埋植物繁殖体制备而成的人工种子，可替代天然种子进行无性繁殖。常规的人工种子研制一直都是建立在植物单独存在的理念之上，即通过离体组织培养产生体细胞胚或不定芽等作为包埋繁殖体，而以植物和微生物共生体为培育材料的研究很少。植物离体组织培养一般建立和维持在无菌条件下，以降低微生物污染物对体外培养的植物材料做有害竞争。而有着生态独特性的植物内生细菌，不仅能和宿主植物协同进化，并能产生具有生物活性的代谢产物而提高植物对生物胁迫或非生物胁迫的抵抗能力。因而引入特定功能的内生细菌来增强人工种子活力和品质，将具有改良植物表型的潜力；因此本专利技术在离体培养条件下，制备一种耐镉芦苇幼苗的人工种子。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种耐镉芦苇幼苗的人工种子的制备方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：步骤如下：步骤一：采集成熟芦苇小穗，去内外稃，以表面无损的芦苇种子为外植体；步骤二：将步骤一中所述的外植体消毒后，置于诱导培养基上诱导出粘性愈伤组织；步骤三：剥取步骤二中所述的粘性愈伤组织，将所述粘性愈伤组织转置于新鲜的诱导培养基上，进一步诱导出胚性愈伤组织；步骤四：将步骤三所述的胚性愈伤组织通过增殖培养，获取胚性培养物；步骤五：将步骤四所述的胚性培养物转至无植物生长调节剂的再生培养基上生成完整植株；步骤六：将步骤五中生成的完整植株进行培养，得到芦苇再生苗；步骤七：将步骤六所述的芦苇再生苗转至无菌组培瓶中进行培养，向所述无菌组培瓶中加入无菌OECD模拟废水；采集活性污泥，将所述活性污泥离心、清洗后加入所述组培瓶中，用组培膜覆盖瓶口，将所述组培瓶于人工气候箱中孵育；步骤八：取经步骤七处理的芦苇再生苗的根组织，将所述根组织的表面进行消毒后研磨成浆，再将所述根组织的浆标准稀释涂布于MS平板上，将所述MS平板放置在恒温培养箱中培养，待菌落长出；步骤九：从步骤八所述的MS平板上挑选草螺菌单菌落，接种至NB液体培养基中培养；然后离心处理所述NB液体培养基以收集菌体，清洗收集的所述菌体，使用MS液体培养基重新悬浮所述菌体制成细菌重悬液，调节所述细菌重悬液中草螺菌的OD600nm值为0.01-1；取至少一个芦苇胚性培养物浸入所述细菌重悬液中孵育，将所述芦苇胚性培养物转至无菌滤纸上除去表面菌体后，再将所述芦苇胚性培养物置于MS平板上进行培养；步骤十：配制人工胚乳；向所述人工胚乳溶液中加入海藻酸钠，配制成溶胶悬液作为种皮基质，同时使用去离子水配制CaCl2溶液作为络合剂，将所述溶胶悬液和CaCl2溶液分别调节pH值后灭菌处理；步骤十一：将步骤九所述的芦苇胚性培养物加入步骤十所述的种皮基质中，均匀混合后，再用无菌巴氏吸管每次吸入一个所述芦苇胚性培养物，滴入步骤十所述的CaCl2溶液中，取出后将所述芦苇胚性培养物清洗晾干，即形成人工种子；步骤十二：将步骤十一所述的人工种子放在MS培养基上进行萌发培养。优选的，所述诱导培养基的制备方法为：向每升MS液体培养基中加入1mg的二氯苯氧乙酸、1mg的萘乙酸、0.5mg的6-苄基腺嘌呤、30g的蔗糖以及0.5mgL-谷氨酰胺；所述增殖培养基的配制方法为向每升MS液体培养基中加入2.5mg的二氯苯氧乙酸、30g的蔗糖以及16g的琼脂；所述再生培养基的配置方法为：向每升MS液体培养基中加入2.5mg的二氯苯氧乙酸、30g的蔗糖以及16g的琼脂。优选的，步骤二所述的消毒为用质量浓度为5％的次氯酸钠进行表面消毒，步骤二所述的粘性愈伤组织为在胚芽鞘末端的白色、半透明、有光泽组织；步骤三所述的胚性愈伤组织为表面具有细小瘤状物和绿点的组织；步骤四所述的胚性愈伤组织通过质量浓度为2.5mgL-1的2,4-D进行增殖培养。优选的，步骤六所述的完整植株的高度为5cm～10cm，培养方式为转至1/2MS液体培养基中进行水培，或以蛭石为栽培基质进行。优选的，步骤七所述的无菌组培瓶的高为20cm、直径为5cm，所述OECD模拟废水的配方为向0.5L去离子水中加入160mg的蛋白胨、110mg的肉膏、30mg的尿素、28mg的K2HPO4、7mg的NaCl、4mg的CaCl2·2H2O和2mg的MgSO4·7H2O，配制成混合液，再用去离子水将所述混合液定容至1L，再用规格为0.22μm的滤膜过滤灭菌，即制成OECD模拟废水；所述加入无菌组培瓶中的OECD模拟废水的体积为150ml；所述活性污泥从污水处理厂采集，所述离心条件为于12000rpm下离心5min，所述清洗为用pH值为7.4的磷酸盐缓冲液清洗3次，所述组培瓶中溶液的终浓度为2.5gVSSL-1，所述组培膜的大小为16cm×16cm，所述人工气候箱中的条件为温度24℃，光照时间16hd-1，光照强度60μmol.m-2.s-1，所述孵育时间为14d。优选的，步骤八所取的根组织的重量为1g，所述研磨在无菌研钵中进行，所述恒温培养箱中的温度为30℃，培养时间为2d～3d。优选的，步骤九所述的培养条件为30℃下150rpm振荡培养24h；离心条件为12000rpm下离心5min；所述清洗为用磷酸缓冲液清洗3次，调节所述细菌重悬液中草螺菌的OD600nm值为0.01；所述芦苇胚性培养物数目为10个，所述细菌重悬液的体积为20mL，所述孵育的时间为30min。优选的，步骤十所述人工胚乳以MS培养基为基本培养基，所述基本培养基中含有质量浓度为3％的蔗糖作为碳源；所述海藻酸钠的质量浓度为3％，所述CaCl2溶液的浓度为100mM，所述溶胶悬液和CaCl2溶液调节后的pH值均为5.8，所述灭菌为121℃下高温高压灭菌20min。优选的，步骤十一中所述的芦苇胚性培养物表面有绿点，所述巴氏吸管的直径为7mm，滴入所述的CaCl2溶液中的时间为30min，用无菌水将所述芦苇胚性培养物清洗5遍后在无菌滤纸上晾干。优选的，步骤十二所述的每个MS培养基内放置20粒人工种子，培养条件为24℃，光照时间为16hd-1，光照强度60μmol.m-2.s-1，重复培养3次。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术在离体培养条件下，调节芦苇胚性培养物对内生草螺菌的亲和能力，再以胚性培养物与草螺菌共生体为繁殖材料，经水凝胶包埋制备成芦苇人工种子，进而通过人工种子垂直传递草螺菌而诱导产生耐镉的芦苇幼苗，适合大规模推广。附图说明图1为本专利技术芦苇愈伤组织诱导与芦苇幼苗再生；图2为本专利技术内生细菌根定本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种耐镉芦苇幼苗的人工种子的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤一：采集成熟芦苇小穗，去内外稃，以表面无损的芦苇种子为外植体；步骤二：将步骤一中所述的外植体消毒后，置于诱导培养基上诱导出粘性愈伤组织；步骤三：剥取步骤二中所述的粘性愈伤组织，将所述粘性愈伤组织转置于新鲜的诱导培养基上，进一步诱导出胚性愈伤组织；步骤四：将步骤三所述的胚性愈伤组织通过增殖培养，获取胚性培养物；步骤五：将步骤四所述的胚性培养物转至无植物生长调节剂的再生培养基上生成完整植株；步骤六：将步骤五中生成的完整植株进行培养，得到芦苇再生苗；步骤七：将步骤六所述的芦苇再生苗转至无菌组培瓶中进行培养，向所述无菌组培瓶中加入无菌OECD模拟废水；采集活性污泥，将所述活性污泥离心、清洗后加入所述组培瓶中，用组培膜覆盖瓶口，将所述组培瓶于人工气候箱中孵育；步骤八：取经步骤七处理的芦苇再生苗的根组织，将所述根组织的表面进行消毒后研磨成浆，再将所述根组织的浆标准稀释涂布于MS平板上，将所述MS平板放置在恒温培养箱中培养，待菌落长出；步骤九：从步骤八所述的MS平板上挑选草螺菌单菌落，接种至NB液体培养基中培养；然后离心处理所述NB液体培养基以收集菌体，清洗收集的所述菌体，使用MS液体培养基重新悬浮所述菌体制成细菌重悬液，调节所述细菌重悬液中草螺菌的OD...

【技术特征摘要】
1.一种耐镉芦苇幼苗的人工种子的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤一：采集成熟芦苇小穗，去内外稃，以表面无损的芦苇种子为外植体；步骤二：将步骤一中所述的外植体消毒后，置于诱导培养基上诱导出粘性愈伤组织；步骤三：剥取步骤二中所述的粘性愈伤组织，将所述粘性愈伤组织转置于新鲜的诱导培养基上，进一步诱导出胚性愈伤组织；步骤四：将步骤三所述的胚性愈伤组织通过增殖培养，获取胚性培养物；步骤五：将步骤四所述的胚性培养物转至无植物生长调节剂的再生培养基上生成完整植株；步骤六：将步骤五中生成的完整植株进行培养，得到芦苇再生苗；步骤七：将步骤六所述的芦苇再生苗转至无菌组培瓶中进行培养，向所述无菌组培瓶中加入无菌OECD模拟废水；采集活性污泥，将所述活性污泥离心、清洗后加入所述组培瓶中，用组培膜覆盖瓶口，将所述组培瓶于人工气候箱中孵育；步骤八：取经步骤七处理的芦苇再生苗的根组织，将所述根组织的表面进行消毒后研磨成浆，再将所述根组织的浆标准稀释涂布于MS平板上，将所述MS平板放置在恒温培养箱中培养，待菌落长出；步骤九：从步骤八所述的MS平板上挑选草螺菌单菌落，接种至NB液体培养基中培养；然后离心处理所述NB液体培养基以收集菌体，清洗收集的所述菌体，使用MS液体培养基重新悬浮所述菌体制成细菌重悬液，调节所述细菌重悬液中草螺菌的OD600nm值为0.01-1；取至少一个芦苇胚性培养物浸入所述细菌重悬液中孵育，将所述芦苇胚性培养物转至无菌滤纸上除去表面菌体后，再将所述芦苇胚性培养物置于MS平板上进行培养；步骤十：配制人工胚乳；向所述人工胚乳溶液中加入海藻酸钠，配制成溶胶悬液作为种皮基质，同时使用去离子水配制CaCl2溶液作为络合剂，将所述溶胶悬液和CaCl2溶液分别调节pH值后灭菌处理；步骤十一：将步骤九所述的芦苇胚性培养物加入步骤十所述的种皮基质中，均匀混合后，再用无菌巴氏吸管每次吸入一个所述芦苇胚性培养物，滴入步骤十所述的CaCl2溶液中，取出后将所述芦苇胚性培养物清洗晾干，即形成人工种子；步骤十二：将步骤十一所述的人工种子放在MS培养基上进行萌发培养。2.根据权利要求1所述的一种耐镉芦苇幼苗的人工种子的制备方法，其特征在于：所述诱导培养基的制备方法为：向每升MS液体培养基中加入1mg的二氯苯氧乙酸、1mg的萘乙酸、0.5mg的6-苄基腺嘌呤、30g的蔗糖以及0.5mgL-谷氨酰胺；所述增殖培养基的配制方法为向每升MS液体培养基中加入2.5mg的二氯苯氧乙酸、30g的蔗糖以及16g的琼脂；所述再生培养基的配置方法为：向每升MS液体培养基中加入2.5mg的二氯苯氧乙酸、30g的蔗糖以及16g的琼脂。3.根据权利要求1所述的一种耐镉芦苇幼苗的人工种子的制备方法，其特征在于：步骤二所述的消毒为用质量浓度为5％的次氯酸钠进行表面消毒，步骤二所述的粘性愈伤组织为在胚芽鞘末端的白色、半透明、有光泽组织；步骤三所述的胚性愈伤组织为表面具有细小...

【专利技术属性】
技术研发人员：石先阳，郜庭，叶成达，
申请(专利权)人：安徽大学，
类型：发明
国别省市：安徽,34