一种利用甘露醇作为渗透调节剂的油菜小孢子培养方法技术

本发明专利技术公开了一种利用甘露醇作为渗透调节剂的油菜小孢子培养方法，属于植物组织培养技术领域。本发明专利技术方法包括以下步骤：取甘蓝型油菜作为小孢子培养的供体植株，取供体植株上的花蕾，灭菌后加入NLN‑13液体培养基，制成悬浮液，过滤所得滤液经离心得到沉淀；加入含甘露醇的NLN液体培养基、秋水仙碱溶液和活性炭混合液，得到小孢子混合悬浮液；经热激处理或直接培养，得到子叶期胚状体；接种至再生培养基中直至再生成芽；切取再生芽接种至生根培养基上生根培养，经炼苗和移栽，得到再生植株；取再生植株的嫩叶检测各再生植株倍性。本发明专利技术方法得到的小孢子质量、再生率和加倍率都得到了很大的提高。

Method for culturing microspore of rape using mannitol as osmotic regulator

The invention discloses a method for culturing microspore of rape using mannitol as an osmotic regulator, belonging to the technical field of plant tissue culture. The method comprises the following steps: Taking the donor plants of Brassica napus as microspore culture, donor plant bud, after adding NLN sterilization medium 13 liquid, made into suspension, filtering the filtrate obtained by centrifugal sedimentation; medium and NLN liquid containing mannitol colchicine solution and activated carbon mixture. Get the microspore suspension; after heat shock treatment or direct culture, from cotyledon stage somatic embryo; regeneration bud culture medium until inoculated regeneration; cut buds were inoculated on MS medium with rooting, seeding and transplanting plantlets; regenerating plant leaves to detect the regenerated plants ploidy. The microspore quality, regeneration rate and doubling rate obtained by the method of the invention have been greatly improved.

【技术实现步骤摘要】
一种利用甘露醇作为渗透调节剂的油菜小孢子培养方法
本专利技术涉及植物组织培养
，具体涉及一种利用甘露醇作为渗透调节剂的油菜小孢子培养方法。
技术介绍
油菜作为世界上第三大油料作物，满足了全世界至少13%的食用油的需求。而我国的产量位居世界首位，具有较高的经济价值。我国栽培的油菜主要有白菜型油菜（Brassicarapa，n=10）、芥菜型油菜（Brassicajuncea，n=18）和甘蓝型油菜（Brassicanapus，n=19）三大类型。其中因甘蓝型油菜的产量高、抗性强、品质优、口感好等特性，自引入我国后被大力推广，种植面积迅速扩增，也是目前国内油菜育种工作者主要的研究对象。在常规油菜品种选育过程中，要育成一个稳定的自交系，至少需要5年。然而，通过油菜小孢子胚胎再生技术，易于进行早期选择，可以在较短的时间里获得纯合的育种材料，显著缩短了育种年限。利用小孢子培养途径比传统选育途径具有明显的优势。通过小孢子培养得到的单倍体植株有利于筛选隐性突变体，提高选择效率，有利于隐性基因控制性状的选择；还可以快速获得自交系的超雄株，构建DH群体作为遗传图谱的构图群体等。因此，建立高效快速的油菜小孢子培养体系具有十分重要的应用价值，是植物基因工程的一个新研究方向。自Licther等（1982）首次报道甘蓝型油菜小孢子培养并获得再生植株以来，许多相关研究者对影响油菜小孢子培养及胚状体再生的诸多因素进行了研究，包括培养基组成和培养条件、供体植株基因型及其生长条件、小孢子发育时期等。但培养基成分中的渗透调节剂的研究鲜有报道。因此，寻找一种更加适合的渗透调节剂对于甘蓝型油菜小孢子的培养显得极其重要。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种利用甘露醇作为渗透调节剂的油菜小孢子培养方法，该方法小孢子出胚率高，小孢子胚状体植株再生率高，加倍率高，大大增加了培养的效率。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种利用甘露醇作为渗透调节剂的油菜小孢子培养方法，包括以下步骤：（1）取甘蓝型油菜作为小孢子培养的供体植株。（2）从供体植株开花后的花序上取花蕾并灭菌，再将灭菌后的花蕾加入到NLN-13液体培养基中，研磨成悬浮液，过滤所得滤液经离心、弃上清液得到沉淀；在沉淀中加入含甘露醇的NLN液体培养基将小孢子细胞密度调至3×105～5×105个细胞/mL，再加入30～50µL秋水仙碱溶液和50～150µL活性炭混合液，得到小孢子混合悬浮液。所述的NLN-13液体培养基，以1L计，组成为：NLN液体培养基1L，蔗糖130g，pH5.6～6.2。所述的含甘露醇的NLN液体培养基，以1L计，组成为：NLN液体培养基1L和蔗糖1～65g，甘露醇18.3～73g，pH5.6～6.2。所述的秋水仙碱溶液的质量百分浓度为0.3～0.8%，将秋水仙碱加到NLN-13液体培养基中配制得到；所述的活性炭混合液，以1L计，组成为：NLN-13液体培养基1L，琼脂糖2～5g和活性炭8～15g。（3）将小孢子混合悬浮液在黑暗条件下于30～33℃恒温热激处理0～3天，取出在黑暗条件下于22～28℃培养10～15天（直至肉眼可见胚状体时），再在黑暗条件下于22～28℃摇动培养5～10天，得到子叶期胚状体。（4）将子叶期胚状体接种至再生培养基中，在每天12～18小时光照、光照强度1000～2000lux和22～28℃条件下培养，形成再生芽。其中，所述再生培养基，以1L计，组成为：MS液体培养基1L，细胞分裂素1～1.5mg，蔗糖20～30g，琼脂粉6.5～8.5g，pH5.6～6.0。（5）切取再生芽接种至生根培养基上，在每天12～18小时光照、光照强度2000～3000lux和22～28℃条件下进行生根培养。将根生长健壮的苗经炼苗和移栽到土壤中，得到再生植株，鉴定倍性。其中，所述生根培养基，以1L计，组成为：MS液体培养基1L，萘乙酸（NAA）0.5～1mg，蔗糖20～30g，琼脂粉6.5～8.5g，pH5.6～6.0。本专利技术中：所述的NLN液体培养基，以1L计，组成为：KNO3125mg，Ca(NO3)2·4H2O500mg，MgSO4·7H2O125mg，KH2PO4125mg，H3BO36.2mg，MnSO4·H2O18.95mg，ZnSO4·7H2O10mg，Na2MoO4·2H2O0.25mg，CuSO4·5H2O0.025mg，CoCl2·6H2O0.025mg，维生素B10.5mg，维生素B60.5mg，生物素0.05mg，叶酸0.5mg，Na2EDTA37.3mg，FeSO4·7H2O27.8mg，肌醇100mg，甘氨酸2mg，烟酸5mg，L-谷氨酰胺800mg，谷胱甘肽30mg，丝氨酸100mg和余量的无菌水，pH5.6～6.2。所述MS液体培养基，以1L计，组分为：NaH2PO4·H2O150mg，CaCl2113.24mg，KI0.75mg，KNO32500mg，（NH4)2SO4134mg，MgSO4·7H2O125mg，H3BO33.0mg，MnSO4·H2O10mg，ZnSO4·7H2O2mg，Na2MoO4·2H2O0.25mg，CuSO4·5H2O0.025mg，CoCl2·6H2O0.025mg，10mg维生素B1，1mg维生素B6，Na2EDTA37.3mg，FeSO4·7H2O27.8mg，肌醇100mg，烟酸1mg，1L无菌水；所述的灭菌采用本领域常规的灭菌方法，可采用次氯酸钠溶液通过表面消毒法将花蕾灭菌15～30分钟，无菌水清洗3～5遍后得到灭菌后的花蕾。所述次氯酸钠溶液，以1L计，组成为：次氯酸钠56～100mL、无水乙醇100mm、洗洁精8～10滴和余量用无菌水补齐。配制的次氯酸钠溶液的体积百分浓度为5.6～10%。优选的技术方案中：步骤（2）中，所述的花蕾为长度2～4mm、花粉母细胞处于单核晚期至双核早期，花蕾数目为80～100个。步骤（2）中，所述的研磨、离心、弃上清及用NLN-13液体培养基重悬浮小孢子细胞的操作可以重复进行1～2次，即步骤（2）的具体步骤可以如下：从供体植株上取适宜的花蕾并灭菌，再将灭菌后的花蕾加入到NLN-13液体培养基中研磨成悬浮液，过滤所得滤液经离心、弃上清液得到沉淀；在沉淀中再次加入NLN-13液体培养基研磨成悬浮液，再次过滤所得滤液经离心、弃上清液，再次得到沉淀；在沉淀中先加入10～20mL含甘露醇的NLN液体培养基，在显微镜下利用血细胞计数器计算小孢子细胞浓度，用一定量的含甘露醇的NLN液体培养基将小孢子细胞浓度调至3×105～5×105个细胞/mL，再加入秋水仙碱溶液和活性炭混合液，得到小孢子混合悬浮液。步骤（2）中，所述的过滤可采用44µm无菌滤网。步骤（2）中，所述的离心的条件一般为：900～1200rpm离心3～5min。步骤（3）中，所述的小孢子混合悬浮液在黑暗条件下于30～33℃恒温热激处理，热激后的小孢子悬浮液能够更促进小孢子细胞的胚胎发生。步骤（3）中，所述的子叶期胚状体可放入3～8℃冰箱中冷藏保存，以延长胚状体的保存期限。步骤（3）中，在黑暗条件下的培养温度优选为25±2℃，即：在黑暗条件下25±2℃于培养至肉眼可见胚状体时，再在黑暗条件下于25±2℃条件下摇动本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用甘露醇作为渗透调节剂的油菜小孢子培养方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）取甘蓝型油菜作为小孢子培养的供体植株；（2）从供体植株开花后的花序上取花蕾并灭菌，再将灭菌后的花蕾加入到NLN‑13液体培养基中，研磨成悬浮液，过滤所得滤液经离心、弃上清液得到沉淀；在沉淀中加入含甘露醇的NLN液体培养基将小孢子细胞密度调至3×10

【技术特征摘要】
1.一种利用甘露醇作为渗透调节剂的油菜小孢子培养方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）取甘蓝型油菜作为小孢子培养的供体植株；（2）从供体植株开花后的花序上取花蕾并灭菌，再将灭菌后的花蕾加入到NLN-13液体培养基中，研磨成悬浮液，过滤所得滤液经离心、弃上清液得到沉淀；在沉淀中加入含甘露醇的NLN液体培养基将小孢子细胞密度调至3×105～5×105个细胞/mL，再加入30～50µL秋水仙碱溶液和50～150µL活性炭混合液，得到小孢子混合悬浮液；所述的NLN-13液体培养基，以1L计，组成为：NLN液体培养基1L，蔗糖130g，pH5.6～6.2，过滤灭菌；所述的含甘露醇的NLN液体培养基，以1L计，组成为：NLN液体培养基1L，蔗糖1～65g，甘露醇18.3～73g，pH5.6～6.2；所述的秋水仙碱溶液的质量百分浓度为0.3～0.8%；所述的活性炭混合液，以1L计，组成为：NLN-13液体培养基1L，琼脂糖2～5g和活性炭8～15g；（3）将小孢子混合悬浮液在黑暗条件下于30～33℃恒温热激处理0～3天，取出在黑暗条件下于22～28℃培养至肉眼可见胚状体时，再在黑暗条件下于22～28℃摇动培养5～10天，得到子叶期胚状体；（4）将子叶期胚状体接种至再生培养基中，在每天12～18小时光照、光照强度1000～2000lux和22～28℃条件下培养，形成再生芽；所述的再生培养基，以1L计，组成为：MS液体培养基1L，细胞分裂素1～1.5mg，蔗糖20～30g，琼脂粉6.5～8.5g，pH5.6～6.0；（5）切取再生芽接种至生根培养基上，在每天12～18小时光照、光照强度2000～3000lux和22～28℃条件下进行生根培养；所述的生根培养基，以1L计，组成为：MS液体培养基1L，萘乙酸0.5～1mg，蔗糖20～30g，琼脂粉6.5～8.5g，pH5.6～6.0。2.根据权利要求1所述的利用...

【专利技术属性】
技术研发人员：耿鑫鑫，徐飞，赵华燕，
申请(专利权)人：武汉生物工程学院，
类型：发明
国别省市：湖北,42