本发明专利技术公开了一种使用草莓茎尖生长点的转基因方法，使用草莓茎尖生长点来做草莓转基因，可直接从田间取材操作，操作过程简单，没有材料的时间限制，不受外界环境影响，随时可以取样；茎尖生长点具有很强的脱分化和再分化的能力，生长点通过长成愈伤组织，再分化芽的过程来长成完整植株，由于生长点的分化能力极强，因此，愈伤组织生长和分化芽的过程都会极大地缩短，一般比叶片叶柄或者茎段分化芽的过程时间都要缩短一半，解决草莓转化效率低的问题，缩短转基因周期，减小转基因工作量和工作强度；此外，生长点分化芽的能力非常强，通常情况下分化芽的能力在100%，即使经过菌液侵染以后，分化能力也能够达到50%以上，这是明显高于叶片、叶柄等其他外植体的。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种使用草莓茎尖生长点的转基因方法。
技术介绍
目前常用的草莓基因转化方法有农杆菌介导法、基因枪法和电击法，其中农杆菌介导的叶盘法是草莓遗传转化的主要方法，也是迄今为止植物转基因研究中最为成熟最常用的一种转基因方法。虽然草莓的遗传转化技术路线成熟，但转化效率很低，获得的转基因植株太少，给转基因植株的后期鉴定工作带来了障碍。即使是非常成熟的草莓叶片转化方法，从叶片转化后到转基因植株筛选出来，获得一株完整的转基因草莓植株也需要10个月到一年时间，如果要在田间开花结果至少需要两年时间，周期比较长。因此，无论如何优化转化体系，使用叶片或者叶柄外植体来做草莓转基因，都无法解决周期长的问题。因此如何寻找一个周期短且转化效率高的方法，是目前在草莓转基因中亟待解决的一个问题。转基因中耗时最长的是叶片侵染之后的再生时间，也就是说在叶片上再生得到再生芽的这个过程是比较长的，而且一般情况下，叶片经过侵染之后再生芽的几率就会降低，一般再生芽几率最高30％，而在这30％中，也只有不到5％的再生芽有可能是转基因的，故获得转基因植株的效率更低。而茎尖用来无性繁殖植株或者组培苗，是常用的方法，之所以长期以来不被用于转基因中，有以下原因：1、操作技术不成熟，茎尖生长点切取的大小操作不慎很容易会使生长点致死；如果切取的生长点过大，菌液不容易侵染进入伤口，造成转基因失败。2、在以往的做基因过程中，采用的基本原理都是外植体再生的原理，也就是首先用菌液侵染叶片或者茎段的伤口，再从叶片或者茎段的伤口处生长愈伤组织，最后从愈伤组织分化出芽。而之所以都不采用茎尖来做转基因，是因为传统都认为，茎尖本来就是一个完整的个体，不具备分化新植株的能力。在草莓的转基因中，目前还有一个问题无法解决，就是不同品种之间的差异，由于不同品种的基因型不同，遗传背景的不同，造成不同品种的转基因效率相差很大。即便目前草莓转基因技术比较成熟，因为基因型的差异，传统的叶片农杆菌介导法也不能够将所有品种都转化成功。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术的目的在于为了克服现有技术的不足，提供一种转化效率高且没有品种转化差异的使用草莓茎尖生长点的转基因方法。技术方案：本专利技术所述的一种使用草莓茎尖生长点的转基因方法，包括以下步骤：(1)在田间取3～5cm长度的草莓茎尖，洗干净茎尖表面，用75％的酒精消毒30秒，无菌水冲洗3次后，用质量分数0.1％的升汞溶液清洗茎尖表面8分钟后用无菌水冲洗茎尖6～8次，冲洗完成后剥去茎尖外边的包叶，在解剖镜下将大小为0.2mm的茎尖生长点切下，倒入茎尖预培养液体培养基S1中的滤纸上，预培养1～2小时；(2)预培养结束以后，将培养基S1中的滤纸取出，放置于茎尖愈伤组织分化培养基S2中，培养5天，生长点周围开始有部分愈伤组织生长；(3)将活化好的菌液倒入无菌培养皿中，从S2培养基中取出滤纸，直接放置于菌液侵染中，侵染10分钟，过程中每隔轻轻摇动培养皿，增加菌液和生长点的的接触面积，侵染完成后将滤纸拿出放置于茎尖愈伤组织共培养培养基S3上共培养3天；(4)共培养结束以后，将滤纸上的茎尖生长点小心用镊子取出，均匀放置于茎尖愈伤组织筛选培养培养基S4上，生长25天后生长点会由愈伤组织长出，此时再将生长点转移至茎尖愈伤组织筛选培养培养基S5上，20天可长出芽，芽长出后在体式荧光显微镜下进行观察，可以明显看出一部分芽有非常亮的绿光发出，这部分芽为抗性愈伤，保留，而一部分没有发光，这部分芽为非抗性芽，去除，通过这个步骤，将非抗性的愈伤去除，保留下的抗性愈伤经过约40天的培养以后，分化出抗性植株，此时再进行一次荧光检测，在体式荧光显微镜下进行观察抗性植株，整个抗性植株叶片和叶柄都发绿光的保留下来，发红光的去除掉；(5)生根培养：抗性植株长到大约2～3厘米高时，将抗性植株转入草莓生根筛选培养基S6上生根，获得完整的抗性苗，再进行一次荧光检测，荧光检测中抗性苗的叶片、叶柄以及根都发亮绿光的确定为转基因植株。进一步，所述茎尖预培养液体培养基S1中包括MS4.4g/L、蔗糖15g/L，pH值为5.8，高压灭菌。进一步，所述茎尖愈伤组织分化培养基S2中包括MS4.4g/L、蔗糖20g/L、琼脂5.5g/L、6-BA 1mg/L，pH值为5.8，高压灭菌，冷却至60℃。进一步，所述茎尖愈伤组织共培养培养基S3中包括MS4.4g/L、蔗糖20g/L、琼脂5.5g/L、TDZ 1mg/L、IBA 0.2mg/L，pH值为5.8，高压灭菌，冷却至60℃。进一步，所述茎尖愈伤组织筛选培养培养基S4中包括MS4.4g/L、蔗糖20g/L、琼脂5.5g/L、TDZ 1mg/L、IBA 0.2mg/L，pH值为5.8，高压灭菌，冷却至60℃加入卡那霉素20mg/L、羧苄青霉素300mg/L。进一步，所述茎尖愈伤组织筛选培养培养基S5中包括MS4.4g/L、蔗糖20g/L、琼脂5.5g/L、6-BA2mg/L、IBA 0.2mg/L，pH值为5.8，高压灭菌，冷却至60℃加入卡那霉素20mg/L、羧苄青霉素300mg/L。进一步，所述生根筛选培养基中包括MS2.2g/L、蔗糖30g/L、琼脂5.5g/L、IBA0.1mg/L，pH值为5.8，高压灭菌，冷却至60℃加入卡那霉素20mg/L、羧苄青霉素300mg/L。进一步，步骤(3)中菌液的活化步骤包括：①将含质粒pK7WG2D农杆菌EHA105在含有50mg/L壮观霉素和50mg/L利福平的LB固体培养基上划线，28℃培养2天；②挑取长好的单菌落2～3个，接种到含50mg/L壮观霉素和50mg/L利福平的50mLLB液体培养基中，28℃，220rpm在摇床中振荡培养12～16h至OD600值0.4；③常温下，5000rmp离心8分钟，去掉上清液，在无菌滤纸上倒扣离心管，尽量将上清液去除，用100mLMS液体重悬菌体，在摇床中振荡培养1小时测定OD600值为0.2～0.3，0.2为最佳。有益效果：1、本专利技术打破传统的草莓转基因必须培育组培苗的取材方式，使用草莓茎尖生长点来做草莓转基因，仅取茎尖生长点的一部分，通过切割，茎尖生长点上面会产生伤口，也能够通过伤口长愈伤组织，进一步从愈伤组织诱导出芽，因此，茎尖生长点具备更强的分化能力，能够更容易的诱导产生新的植株，缩短转基因的时间；且可直接从田间取材操作，操作过程简单，没有材料的时间限制，不受外界环境影响，随时可以取样；2、茎尖生长点具有很强的脱分化和再分化的能力，生长点通过长成愈伤组织，再分化芽的过程来长成完整植株，由于生长点的分化能力极强，因此，愈伤组织生长和分化芽的过程都会极大地缩短，一般比叶片叶柄或者茎段分化芽的过程时间都要缩短一半，解决草莓转化效率低的问题，缩短转基因周期，减小转基因工作量和工作强度；此外，生长点分化芽的能力非常强，通常情况下分化芽的能力在100％，即使经过菌液侵染以后，分化能力也能够达到50％以上，这是明显高于叶片、叶柄等其他外植体的；3、茎尖生长点无论在什么品种中，活力都是一样的，因此使用茎尖生长点作为转基因的外植体，可解决转基因中品种的限制，打破叶片农杆菌介导法在本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种使用草莓茎尖生长点的转基因方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）在田间取3~5cm长度的草莓茎尖，洗干净茎尖表面，用75%的酒精消毒30秒，无菌水冲洗3次后，用质量分数0.1%的升汞溶液清洗茎尖表面8分钟后用无菌水冲洗茎尖6~8次，冲洗完成后剥去茎尖外边的包叶，在解剖镜下将大小为0.2mm的茎尖生长点切下，倒入茎尖预培养液体培养基S1中的滤纸上，预培养1~2小时；（2）预培养结束以后，将培养基S1中的滤纸取出，放置于茎尖愈伤组织分化培养基S2中，培养5天，生长点周围开始有部分愈伤组织生长；（3）将活化好的菌液倒入无菌培养皿中，从S2培养基中取出滤纸，直接放置于菌液侵染中，侵染10分钟，过程中每隔2分钟轻轻摇动培养皿，增加菌液和生长点的的接触面积，侵染完成后将滤纸拿出放置于茎尖愈伤组织共培养培养基S3上共培养3天；（4）共培养结束以后，将滤纸上的茎尖生长点小心用镊子取出，均匀放置于茎尖愈伤组织筛选培养培养基S4上，生长25天后生长点会由愈伤组织长出，此时再将生长点转移至茎尖愈伤组织筛选培养培养基S5上， 20天可长出芽，芽长出后在体式荧光显微镜下进行观察，可以明显看出一部分芽有非常亮的绿光发出，这部分芽为抗性愈伤，保留，而一部分没有发光，这部分芽为非抗性芽，去除，通过这个步骤，将非抗性的愈伤去除，保留下的抗性愈伤经过约40 天的培养以后，分化出抗性植株，此时再进行一次荧光检测，在体式荧光显微镜下进行观察抗性植株，整个抗性植株叶片和叶柄都发绿光的保留下来，发红光的去除掉；（5）生根培养：抗性植株长到大约2~3厘米高时，将抗性植株转入草莓生根筛选培养基S6上生根，获得完整的抗性苗，再进行一次荧光检测，荧光检测中抗性苗的叶片、叶柄以及根都发亮绿光的确定为转基因植株。...
【技术特征摘要】
1.一种使用草莓茎尖生长点的转基因方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）在田间取3~5cm长度的草莓茎尖，洗干净茎尖表面，用75%的酒精消毒30秒，无菌水冲洗3次后，用质量分数0.1%的升汞溶液清洗茎尖表面8分钟后用无菌水冲洗茎尖6~8次，冲洗完成后剥去茎尖外边的包叶，在解剖镜下将大小为0.2mm的茎尖生长点切下，倒入茎尖预培养液体培养基S1中的滤纸上，预培养1~2小时；（2）预培养结束以后，将培养基S1中的滤纸取出，放置于茎尖愈伤组织分化培养基S2中，培养5天，生长点周围开始有部分愈伤组织生长；（3）将活化好的菌液倒入无菌培养皿中，从S2培养基中取出滤纸，直接放置于菌液侵染中，侵染10分钟，过程中每隔2分钟轻轻摇动培养皿，增加菌液和生长点的的接触面积，侵染完成后将滤纸拿出放置于茎尖愈伤组织共培养培养基S3上共培养3天；（4）共培养结束以后，将滤纸上的茎尖生长点小心用镊子取出，均匀放置于茎尖愈伤组织筛选培养培养基S4上，生长25天后生长点会由愈伤组织长出，此时再将生长点转移至茎尖愈伤组织筛选培养培养基S5上， 20天可长出芽，芽长出后在体式荧光显微镜下进行观察，可以明显看出一部分芽有非常亮的绿光发出，这部分芽为抗性愈伤，保留，而一部分没有发光，这部分芽为非抗性芽，去除，通过这个步骤，将非抗性的愈伤去除，保留下的抗性愈伤经过约40 天的培养以后，分化出抗性植株，此时再进行一次荧光检测，在体式荧光显微镜下进行观察抗性植株，整个抗性植株叶片和叶柄都发绿光的保留下来，发红光的去除掉；（5）生根培养：抗性植株长到大约2~3厘米高时，将抗性植株转入草莓生根筛选培养基S6上生根，获得完整的抗性苗，再进行一次荧光检测，荧光检测中抗性苗的叶片、叶柄以及根都发亮绿光的确定为转基因植株。2. 根据权利要求1所述的使用草莓茎尖生长点的转基因方法，其特征在于：所述茎尖预培养液体培养基S1中包括MS4.4g/L、蔗糖15g/L，pH值为5.8，高压灭菌。3.根据权利要求1所述的使用草莓茎尖生长点的转基因方法，其特征在于：所述茎尖愈伤组织分化培养基S2中包括MS4.4g/L、蔗糖20g/L、琼脂 5.5 g/L、6-BA 1m...
【专利技术属性】
技术研发人员：王媛花，颜志明，蔡善亚，冯英娜，
申请(专利权)人：江苏农林职业技术学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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