一种以牛大力花药为外植体的再生方法技术

本发明专利技术属植物组培技术领域，涉及一种以牛大力花药为外植体的再生方法，是以牛大力花药为材料经愈伤组织诱导、胚性愈伤组织诱导及增殖，将增殖后的胚性愈伤组织诱导形成胚状体，再由胚状体诱导发育形成小植株，最后将小植株进行壮苗培养形成正常植株。本发明专利技术以牛大力花药为外植体，通过愈伤组织诱导、胚性愈伤组织诱导、胚发育和胚萌发成苗的过程，建立了一种牛大力的再生体系，并创建了子叶型胚的二次诱导体系，能长期提供胚性愈伤组织，可为牛大力诱变育种、转基因育种以及牛大力的产业化发展提供技术支持。

Method for regenerating anther with strong anther of cattle

The invention belongs to the technical field of plant tissue culture, relates to a method for regenerating the millettiaspeciosachamp anthers as explants, in anthers of millettiaspeciosachamp after callus induction, embryogenic callus induction and proliferation, the proliferation of embryogenic callus induction of embryoid body formation, and then by the embryoid formation small plants, the small plants formed normal plant seedling culture. The invention uses millettiaspeciosachamp anthers as explants, the callus induction, embryogenic callus induction, embryo development and embryo germination and seedling regeneration process, a millettiaspeciosachamp, two induction system and create the cotyledonary embryo, can provide long-term embryogenic calli, technology support for the industrialization development of cattle breeding, transgenic breeding and vigorously cattle vigorously.

【技术实现步骤摘要】
一种以牛大力花药为外植体的再生方法
本专利技术属植物组培
，涉及一种以牛大力花药为材料的再生方法，具体是一种利用牛大力花药诱导分化胚性愈伤组织后，再诱导胚状体萌发，萌发的胚状体发育为植株的组织培养方法。
技术介绍
牛大力(Calleryaspeciosa)，学名美丽鸡血藤，又名猪脚笠、金钟根、山莲藕、倒吊金钟、大力薯，为豆科(Leguminosae)鸡血藤属(Callerya)植物。牛大力是一种药食两用植物，我国野生分布在广东、广西、云南、福建和海南等地，《本草纲目》记载，牛大力具有健脾润肺、养肾补虚、舒筋活络之功效，适用于肾虚，血气不旺，风湿骨痛，经常咳嗽患有急慢性支气管炎及吸烟人士。国内南方各省，包括香港，民间有时常用牛大力泡酒、煲汤的饮食习惯，能强身健体，增强体质，提高抗病力。随着市场需求量的不断增加，野生资源已经接近枯竭，人工种植已成为牛大力产业化发展的有效途径,如何获取牛大力优良新品种已成为亟待解决的问题。长期以来牛大力一直处于野生状态，优良新品种稀缺，从杂合度很高的牛大力野生资源中获得纯化株系，需要很长时间的自交过程，严重影响了产业的发展。因此，通过组织培养技术培育牛大力优良无性系是获得牛大力新品(系)种的有效途径。经检索尚未见以牛大力花药为外植体进行再生的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种以牛大力花药为外植体的再生方法，利用牛大力花药进行培养并再生，可以在短时间内纯化牛大力种质，为不同种质间杂交育种提供材料。本专利技术所采用的技术方案：一种以牛大力花药为外植体的再生方法，包括牛大力花药获取、愈伤组织诱导、胚性愈伤组织诱导及增殖、胚状体诱导及发育和萌发成苗的过程，其具体步骤如下：1、外植体获取在牛大力盛花期，选取花瓣即将露出花萼或露出花萼1mm以内的花蕾，用0.1％HgCl2消毒10min后，无菌水冲洗4次，吸干水分后取花药；或75％酒精喷雾，于超净工作台吹干后取花药；或直接依次剥掉花萼和部分花瓣，用尖头镊子小心的取花药。污染率低于5％，存活率(不变黑或不变白者)90％以上。2、愈伤组织及胚性愈伤组织诱导将获取的牛大力花药接种在愈伤组织培养基上，培养温度24～26℃，暗培养。培养25天时，肉眼可见花药分化出少量愈伤组织；继续培养，60天后，部分愈伤组织形成胚性愈伤组织。所述愈伤组织培养基是以改良的MS为基本培养基，并添加2,4-D3.5mg/L以下、6-BA0.2～2.0mg/L、蔗糖30g/L、卡拉胶6.5g/L，pH值为5.8。3、胚性愈伤组织增殖诱导将胚性愈伤组织转接子叶胚诱导培养基上，培养条件：温度24～26℃，光照时间10～12h/d，光照强度20～30μmol·m-2·s-1。培养60～90天，部分胚性愈伤组织发育为子叶型胚；将子叶型胚切成2×2～5mm的小块，接入增殖培养基上，培养条件：温度24～26℃，光照时间10～12h/d，光照强度20～30μmol·m-2·s-1。培养40天后，可二次分化出胚性愈伤组织，从而实现胚性愈伤组织增殖。所述子叶胚诱导培养基是以改良的MS为基本培养基，并添加6-BA2mg/L以下、NAA0.5mg/L以下、水解乳蛋白(CH)1.0mg/L、谷氨酰胺(Glu)0.5mg/L、蔗糖30g/L、卡拉胶6.5g/L、10％椰子水(CW)，pH5.8。所述增殖培养基是以改良的MS为基本培养基，并添加2,4-D2.0mg/L、BA0.5mg/L、CH1.0mg/L、Glu0.5mg/L、10％椰子水、蔗糖30g/L、卡拉胶6.5g/L，pH5.8。4、胚状体的诱导将增殖后的胚性愈伤组织转接到胚诱导培养基上，培养条件：温度24～26℃，光照时间10～12h/d，光照强度20～30μmol·m-2·s-1。培养60～90天，部分胚性愈伤组织发育胚状体。所述胚诱导培养基以改良的MS为基本培养基，添加6-BA1.0mg/L以下、NAA0.5mg/L以下、CH1.0mg/L、Glu0.5mg/L、蔗糖30g/L、卡拉胶6.5g/L，pH值为5.8。5、胚状体发育诱导及壮苗培养将诱导出的胚状体单个转接到胚发育培养基上，培养条件：温度24～26℃，光照时间10～12h/d，光照强度20～30μmol·m-2·s-1。培养90天后，形成具有芽和根的完整小植株。将发育成的小植株转接到壮苗培养基上，培养条件：温度24～26℃，光照时间10～12h/d，光照强度20～30μmol·m-2·s-1。培养60天后，小植株茎伸长至5cm以上，叶片数2-3，部分展开，根系发育良好，形成壮苗。所述胚发育培养基是以改良的MS为基本培养基，并添加6-BA0.1～0.5mg/L、NAA0.01～0.15mg/L、10％CW、蔗糖30g/L、卡拉胶6.5g/L，pH5.8。所述壮苗培养基是以改良MS为基本培养基，并添加NAA0.1～0.5mg/L、IBA0.1～1.0mg/L、蔗糖30g/L、卡拉胶6.5g/L，pH5.8。上述改良的MS培养基是在MS培养基的基础上，在其它成分和含量不变的条件下将肌醇浓度提高到原来的2倍，即肌醇的浓度为200mg/L。本专利技术以牛大力花药为外植体，通过愈伤组织诱导、胚性愈伤组织诱导、胚发育和胚萌发成苗的过程，建立了一种牛大力的组织培养体系，并创建了子叶型胚的二次胚性愈伤组织诱导体系，能长期提供胚性愈伤组织，可为牛大力诱变育种、转基因育种以及牛大力的产业发展提供技术支持。具体实施方式下面结合实施例，对本专利技术的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。一、牛大力花药培养及植株再生本专利技术实施例中所采用的改良的MS培养基是在MS培养基的基础上，将其中的肌醇浓度提高到原来的2倍，即肌醇的浓度为200mg/L，其它成分和含量不变。实施例一1、外植体获取在牛大力盛花期，取花瓣即将露出花萼或露出花萼1mm以内的花蕾，用0.1％HgCl2消毒10min后，无菌水冲洗4次，吸干水分后，依次剥掉花萼和部分花瓣，用尖头镊子小心的取花药。2、愈伤组织及胚性愈伤组织诱导将花药接种在愈伤组织培养基(改良MS+1.5mg/L2,4-D+1.5mg/L6-BA+蔗糖30g/L+卡拉胶6.5g/L，pH值为5.8)上，培养温度24～26℃，暗培养。培养25天时，肉眼可见花药分化出少量愈伤组织；在不更换培养基、不继代的条件下继续培养，60天后，部分愈伤组织形成胚性愈伤组织。3、胚性愈伤组织增殖诱导将胚性愈伤组织转接子叶胚诱导培养基(改良MS+0.8mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+1.0mg/LCH+0.5mg/LGlu+10％CW+30g/L蔗糖+6.5g/L卡拉胶，pH5.8)上，培养条件：温度24～26℃，光照时间10～12h/d，光照强度20～30μmol·m-2·s-1。培养60～90天，部分胚性愈伤组织发育为子叶型胚。将子叶型胚切成2×2～5mm的小块，接入增殖培养基(改良MS+2.0mg/L2,4-D+0.5mg/LBA+1.0mg/LCH+0.5mg/LGlu+10％CW+蔗糖30g/L+卡拉胶6.5g/L，pH5.8)上，培养条件：温度本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种以牛大力花药为外植体的再生方法，其特征在于，其具体步骤如下：1)、外植体获取在牛大力盛花期，选取花瓣即将露出花萼或露出花萼1mm以内的花蕾，用0.1％HgCl

【技术特征摘要】
1.一种以牛大力花药为外植体的再生方法，其特征在于，其具体步骤如下：1)、外植体获取在牛大力盛花期，选取花瓣即将露出花萼或露出花萼1mm以内的花蕾，用0.1％HgCl2消毒10min后，无菌水冲洗4次，吸干水分后取花药；或75％酒精喷雾，于超净工作台吹干后取花药；或直接依次剥掉花萼和部分花瓣，用尖头镊子小心的取花药；2)、愈伤组织及胚性愈伤组织诱导将获取的牛大力花药接种在愈伤组织培养基上，培养温度24～26℃，暗培养；培养25天时，肉眼可见花药分化出少量愈伤组织；继续培养，60天后，部分愈伤组织形成胚性愈伤组织；所述愈伤组织培养基是以改良的MS为基本培养基，并添加2,4-D3.5mg/L以下、6-BA0.2～2.0mg/L、蔗糖30g/L、卡拉胶6.5g/L，pH值为5.8；3)、胚性愈伤组织增殖诱导将胚性愈伤组织转接子叶胚诱导培养基上，培养条件：温度24～26℃，光照时间10～12h/d，光照强度20～30μmol·m-2·s-1；培养60～90天，部分胚性愈伤组织发育为子叶型胚；将子叶型胚切成2╳2～5mm的小块，接入增殖培养基上，培养条件：温度24～26℃，光照时间10～12h/d，光照强度20～30μmol·m-2·s-1；培养40天后，可分化出胚性愈伤组织；所述子叶胚诱导培养基是以改良的MS为基本培养基，并添加6-BA2mg/L以下、NAA0.5mg/L以下、CH1.0mg/L、Glu0.5mg/L、蔗糖30g/L、卡拉胶6.5g/L、10％椰子水，pH5.8；所述增殖培养基是以改良的MS为基本培养基，并添加2,4-D2.0mg/L、BA0.5mg/...

【专利技术属性】
技术研发人员：李志英，黄碧兰，徐立，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所，
类型：发明
国别省市：海南,46