一种濒危羊踯躅离体组织培养繁殖与保存的方法技术

本发明专利技术公开了一种濒危羊踯躅离体组织培养繁殖与保存的方法，建立了羊踯躅组织培养过程中最佳快速繁殖体系和保存体系，包括最适宜的外植体的选择方法，高效的多重灭菌方法，羊踯躅离体生长繁殖与保存的最适宜培养基组份以及不定芽生根、驯化移栽条件的控制等关键技术问题，最终实现羊踯躅在短时间内大量、快速、高质量的繁殖。本发明专利技术可使羊踯躅试管苗的分化率达到达100％，不定芽增殖系数月增殖倍数达8-10.5，40d后生根率和驯化成活率均在85％以上。这可以有效地满足人们对羊踯躅日益增长的需求，进而减少人们对野生羊踯躅的破坏，有利于濒危野生羊踯躅的保护，具有巨大的科研价值、经济价值和生态价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于植物生物技术与细胞工程
，涉及一种濒危羊踯躅离体组织培养繁殖与保存的方法。
技术介绍
羊踯躅(RhododendronmolleG.Don)，又名闹羊花和八厘麻等，是中国羊踯躅亚属中仅有的一个原生种，春季开花，花鲜黄色，可用于观赏，是杜鹃花色品种改良的重要资源。此外，羊踯躅全株器官均含有多种活性成分，花、根、果实等均可供药用，其提取物可治疗类风湿、温疟、慢性肾小球肾炎和高血压等，在医药工业上作为麻醉剂、镇痛剂，在农业上用作杀虫剂，对血吸虫和多种害虫均具有非常好的灭杀效果。上世纪80年代以前，羊踯躅遍及华中、华南，西南地区也有少量分布。野生的羊踯躅主要是通过种子繁殖、扦插繁殖等方式。但由于羊踯躅对生境要求苛刻，细小的种子在自然条件下发芽困难，而且对其人工扦插或分株繁殖也很难成活，加上人们的滥挖乱采及生境的破坏，羊踯躅的生殖环节受到严重影响，羊踯躅野外分布的地区和种群数量急剧减少，栖息地已呈“岛屿化”，有些省份野外已难见其踪影，野生的羊踯躅早已无法满足人们对其的需要，羊踯躅濒于灭绝的风险日益加剧，亟待采取有效的方法加以保护和繁殖，使之能够规模化的生产，满足人们日益增长的需求。植物生物技术与组织培养技术繁殖濒危植物不受季节和环境条件等因素的影响，是解决上述难题的重要途径。本专利技术要解决的首要问题就是找到羊踯躅组织培养过程中外植体有效的灭菌方法及其生长繁殖的最适宜培养基组份以及不定芽生根、驯化移栽条件的控制等关键技术问题，进而建立起羊踯躅的快速繁殖体系，最终实现羊踯躅在短时间内大量、快速、高质量的繁殖。这可以有效地满足人们对羊踯躅日益增长的需求，进而减少人们对野生羊踯躅的破坏，有利于濒危野生羊踯躅的保护，具有巨大的科研价值、经济价值和生态价值。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种濒危羊踯躅离体组织培养繁殖与保存的方法，针对羊踯躅野外分布的地区和种群数量急剧减少，细小的种子在自然条件下发芽困难，而且对其人工扦插或分株繁殖也很难成活，组织培养过程中存在外植体灭菌困难，无菌外植体的获得率低，外植体分化和增殖困难等问题的不足，本专利技术提供一种濒危羊踯躅离体规模化繁殖与保存的方法，为实现羊踯躅在短时间内大量、快速、高质量的繁殖提供技术支撑，为满足人们对羊踯躅日益增长的需求提供组培苗，为保护野生濒危羊踯躅提供技术支持和参考。本专利技术通过以下技术方案来实现的：(1)外植体的活体增殖与选择：为了能收集更多分生能力好的腋芽，将野外活体羊踯躅的顶芽剪去，10-20天后每一枝条可新萌发3-5个新的嫩腋芽，等腋芽长至1-2cm时，从腋芽基部剪取腋芽，经自来水冲洗干净，滤纸吸干水滴后装入无菌容器备用；(2)多重表面灭菌流程：外植体用软毛笔刷洗枝叶，用自来水洗去枝叶上的灰尘后，在超净台上放入无菌瓶中，用70％体积比的乙醇表面灭菌0.5-1分钟，接着多重灭菌法灭菌，即先用10％的双氧水H2O2表面灭菌10min，所述双氧水含0.5％的吐温20，无菌水冲洗2-3次，接着再用0.1％的升汞HgC12，所述升汞含0.5％的吐温20，灭菌5-8min，最后用无菌水冲洗3-5次，灭菌后的腋芽外植体备用；(3)接种初代培养：去除外植体接种在腋芽启动分化的培养基上，培养基组成为改良的6,7-V+ZT玉米素1.0mg/L，培养基的蔗糖用量30g/L，琼脂为0.8％，pH值为5.6，培养参数为25士2℃，相对湿度为60-70％，光照强度为2000-2500Lx，光照时间14h/d，技术指标为外植体污染率低于10％-20％；(4)分化培养：将步骤3中的腋芽长至4-6cm时，去除老叶，取新长出的外植体顶芽和茎段约1-2cm转接到分化扩繁培养基上6,7-V+ZT1.5mg/L+NAA0.05mg/L+2,4-D0.05mg/L进行脱分化和增殖培养20-40d，脱分化率达100％；培养条件同步骤3；(5)离体快速繁殖培养：将步骤4中经脱分化的不定芽转至繁殖培养基上，培养成份和培养条件同步骤3，每瓶40-50ml左右培养基中接种3-4个1-2cm的不定芽，从组培苗茎基部分化产生出丛生苗，技术参数为不定芽增殖系数达8-10.5，不定芽的离体保存培养基可采用1/2的6,7-V+玉米素ZT1.0mg/L，培养基的蔗糖用量15/L，培养温度15-20℃，不定芽可以3-4个月转接一次，可以大大减少转接次数。(6)生根培养及驯化移栽：切取步骤5中取健壮、整齐一致的芽用于生根，生根培养基为1/26,7-V基本培养基添加0.05mg/LNAA上的培养基上生根，培养条件同步骤3，30-40d后揭去已生根苗的瓶盖使组培苗适应自然环境2-5d，随后移栽入营养钵中，基质为珍珠岩，营养土＝1：2，进行驯化移栽，营养钵用小拱棚保湿，相对湿度位70-80％，温度为20-25℃，10-15d后逐渐揭开棚膜，15d后完全揭开小拱棚膜，技术参数为生根率和驯化成活率均达85％以上。本专利技术的技术效果是：本专利技术要解决的首要问题就是找到羊踯躅组织培养过程中外植体有效的灭菌方法及其生长繁殖的最适宜培养基组份以及不定芽生根、驯化移栽条件的控制等关键技术问题，进而建立起羊踯躅的快速繁殖体系，最终实现羊踯躅在短时间内大量、快速、高质量的繁殖，这可以有效地满足人们对羊踯躅日益增长的需求，进而减少人们对野生羊踯躅的破坏，有利于濒危野生羊踯躅的保护，具有巨大的科研价值、经济价值和生态价值。附图说明图1为去掉顶芽的羊踯躅枝条，在活体枝条上萌发腋芽；1-2cm新萌发的腋芽用作外植体。图2为羊踯躅在分化培养基上进行脱分化，再生出一定数量的不定芽。图3为羊踯躅不定芽在增殖培养基上增殖培养，1个不定芽可繁殖8-15个芽。图4为羊踯躅离体繁殖的芽在生根培养生根。图5为驯化成活的羊踯躅组培苗。具体实施方式下面将结合附图实施例详细说明本专利技术所具有的有益效果，旨在帮助阅读者更好地理解本专利技术的实质，但不能对本专利技术的实施和保护范围构成任何限定。本专利技术是这样实现的，所述方法包括以下步骤：(1)选择外植体：将野外活体羊踯躅(RhododendronmolleG.Don)枝条的顶芽剪去，10-20天后每一枝条可新萌发3-5个新的嫩腋芽(图1)。等腋芽长至1-2cm时，从腋芽基部剪取腋芽，经自来水冲洗干净，滤纸吸干水滴后装入无菌容器备用；实验结果表明，采用新萌发腋芽为外植体的再生率高(90％以上)，污染率低(低于10％)，周期短(2-4周即可分化增殖)。如果采用顶芽和枝条为外植体，内生本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种濒危羊踯躅离体组织培养繁殖与保存的方法，其特征在于，(1)外植体的活体增殖与选择：为了能收集更多分生能力好的腋芽，将野外活体羊踯躅的顶芽剪去，10‑20天后每一枝条可新萌发3‑5个新的嫩腋芽，等腋芽长至1‑2cm时，从腋芽基部剪取腋芽，经自来水冲洗干净，滤纸吸干水滴后装入无菌容器备用；(2)多重表面灭菌流程：外植体用软毛笔刷洗枝叶，用自来水洗去枝叶上的灰尘后，在超净台上放入无菌瓶中，用70％体积比的乙醇表面灭菌0.5‑1分钟，接着多重灭菌法灭菌，即先用10％的双氧水H2O2表面灭菌10min，所述双氧水含0.5％的吐温20，无菌水冲洗2‑3次，接着再用0.1％的升汞HgC12，所述升汞含0.5％的吐温20，灭菌5‑8min，最后用无菌水冲洗3‑5次，灭菌后的腋芽外植体备用；(3)接种初代培养：去除外植体接种在腋芽启动分化的培养基上，培养基组成为改良的6,7‑V+ZT玉米素1.0mg/L，培养基的蔗糖用量30g/L，琼脂为0.8％，pH值为5.6，培养参数为25士2℃，相对湿度为60‑70％，光照强度为2000‑2500Lx，光照时间14h/d，技术指标为外植体污染率低于10％‑20％；(4)分化培养：将步骤3中的腋芽长至4‑6cm时，去除老叶，取新长出的外植体顶芽和茎段约1‑2cm转接到分化扩繁培养基上6,7‑V+ZT 1.5mg/L+NAA 0.05mg/L+2,4‑D 0.05mg/L进行脱分化和增殖培养20‑40d，脱分化率达100％；培养条件同步骤3；(5)离体快速繁殖培养：将步骤4中经脱分化的不定芽转至繁殖培养基上，培养成份和培养条件同步骤3,每瓶40‑50ml左右培养基中接种3‑4个1‑2cm的不定芽，从组培苗茎基部分化产生出丛生苗，技术参数为不定芽增殖系数达8‑10.5；(6)羊踯躅不定芽的离体保存培养：离体培养的不定芽可以在离体条件下延缓生长，采用的培养基为1/2的6,7‑V+玉米素ZT 1.0mg/L，培养基的蔗糖用量15/L，培养温度15‑20℃，其他培养的环境条件同步骤(3)。技术参数为不定芽3‑4个月转接一次；(7)生根培养及驯化移栽：切取步骤5中取健壮、整齐一致的芽用于生根，生根培养基为1/26,7‑V基本培养基添加0.05mg/L NAA上的培养基上生根，培养条件同步骤3，30‑40d后揭去已生根苗的瓶盖使组培苗适应自然环境2‑5d，随后移栽入营养钵中，基质为珍珠岩，营养土＝1：2，进行驯化移栽，营养钵用小拱棚保湿，相对湿度位70‑80％，温度为20‑25℃，10‑15d后逐渐揭开棚膜，15d后完全揭开小拱棚膜，技术参数为生根率和驯化成活率均达85％以上。...

【技术特征摘要】
1.一种濒危羊踯躅离体组织培养繁殖与保存的方法，其特征在于，(1)外植体的活体增
殖与选择：为了能收集更多分生能力好的腋芽，将野外活体羊踯躅的顶芽剪去，10-20天后
每一枝条可新萌发3-5个新的嫩腋芽，等腋芽长至1-2cm时，从腋芽基部剪取腋芽，经自来水
冲洗干净，滤纸吸干水滴后装入无菌容器备用；
(2)多重表面灭菌流程：外植体用软毛笔刷洗枝叶，用自来水洗去枝叶上的灰尘后，在
超净台上放入无菌瓶中，用70％体积比的乙醇表面灭菌0.5-1分钟，接着多重灭菌法灭菌，
即先用10％的双氧水H2O2表面灭菌10min，所述双氧水含0.5％的吐温20，无菌水冲洗2-3次，
接着再用0.1％的升汞HgC12，所述升汞含0.5％的吐温20，灭菌5-8min，最后用无菌水冲洗
3-5次，灭菌后的腋芽外植体备用；
(3)接种初代培养：去除外植体接种在腋芽启动分化的培养基上，培养基组成为改良的
6,7-V+ZT玉米素1.0mg/L，培养基的蔗糖用量30g/L，琼脂为0.8％，pH值为5.6，培养参数为
25士2℃，相对湿度为60-70％，光照强度为2000-2500Lx，光照时间14h/d，技术指标为外植
体污染率低于10％-20％；
(4)分化培养：将步骤3中的腋芽长至4-6cm时，去除老叶，取新长出的外植体顶芽和茎
段约1-2cm转接到分...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗向东，刘梦露，戴亮芳，刘李珠，杨雪琴，余尚耘，
申请(专利权)人：江西师范大学，
类型：发明
国别省市：江西;36