【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程领域，具体涉及一种玉米雄性育性调控基因zmms2085及其突变体与应用。更具体地，本专利技术涉及植物雄性育性调控基因zmms2085、zmms2085编码蛋白、zmms2085的辐射诱变和基因敲除突变体，以及zmms2085基因、蛋白和突变体在杂交育种中的应用。
技术介绍
1、植物雄性不育突变是自然界中十分普遍的现象，至少己在43个科、162个属的617个物种中发现了雄性不育突变体。在遗传上植物雄性不育分为细胞核雄性不育、细胞质雄性不育和细胞核细胞质互作雄性不育三大类：(1)细胞核雄性不育由细胞核基因突变产生，可分为显性突变和隐性突变，也可分为孢子体基因突变和配子体基因突变。其中，显性突变和配子体基因突变只能通过雌配子遗传；隐性突变既可通过雌配子也可通过雄配子进行遗传，而且遵循孟德尔定律。目前已克隆了一些孢子体隐性核不育基因，如拟南芥的ms2，玉米的ms45和玉米的mil1等；一些配子体隐性核不育基因也被克隆，如拟南芥的两个小孢子有丝分裂异常的突变体sidecar pollen和gemini pollen；玉米上还克隆了一个孢子体显性核不育基因ms44。(2)细胞质雄性不育则是由细胞质基因控制，并没有相对应的核恢复基因，属于母性遗传。(3)细胞核细胞质互作雄性不育由细胞质基因和细胞核基因共同控制，其实质是细胞质与细胞核的遗传物质不匹配的结果。不育细胞质是由一些线粒体基因突变引起，但有相对应的核恢复基因，能够抑制不育细胞质基因；不育细胞质基因可产生新的蛋白质，能够影响线粒体正常功能。在育恢复基因方面，目前玉米
2、玉米是杂种优势利用的典范，其中杂交育种和制种技术的关键均在于母本的去雄。人工去雄相对容易，可以使用机械去雄、化学杀雄等方法，但是这些策略也存在一些问题：一方面使用这些方法大大增加了制种的成本，另一方面因人工去雄的不彻底或不及时，会降低杂交种的纯度，造成生产上的大面积减产，最终造成经济损失。因此，提高杂交种种子纯度是当前玉米生产上急待解决的问题，而利用雄性不育系制种是提高杂交种质量最为有效的途径之一。
3、玉米核雄性不育材料是一种宝贵的种质资源，对玉米杂交种生产具有极其重要的意义，但长期以来，由于纯合核雄性不育系无法繁殖保持等问题，这类材料在实际生产上一直没有得到有效的利用。随着新的核雄性不育材料的不断发现，玉米育种家对其进行了多方面的研究和应用方面的尝试，如利用标记性状与不育性的紧密连锁关系，开发了粒色标记系统法、黄绿苗连锁标记法和多花丝连锁标记体系等，但是由于标记性状与不育性连锁不完全、标记性状鉴定困难、鉴定时期滞后等问题，这些方法和尝试核不育材料在玉米生产中的应用并没有得到推广。
技术实现思路
1、为了克服目前杂交玉米育制种技术中存在的关键性缺陷，创造和利用新类型的不育系将是重要的突破口。本专利技术提供了一种作物育性基因及基于该基因突变所产生的隐性核不育类型的雄性不育系。
2、该不育系育性稳定，只受核编码的单基因调控，不受光温环境的影响。该不育系的育性恢复基因广泛存在于玉米种质资源中，也可以通过转野生型基因恢复育性。该基因和该基因突变产生的不育系为研发玉米新型杂交育制种技术提供了元件，为解决现有技术存在的问题奠定了基础。下文描述的任何方法都可与本专利技术所提供的相应核苷酸序列一起使用，例如，将所述雄性育性基因的突变体序列引入植株以导致植株雄性不育、使植株内源序列突变、向植株中引入该序列的反义序列、使用发卡形式、或将其与其它核苷酸序列连接起来调控植株的表型，或者是本领域技术人员已知的可用于影响植株的雄性生育力的多种方法中的任一方法。
3、具体的，本专利技术通过对玉米突变株的大量筛选和分析后，发现了花粉败育调控基因zmms2085，其位于玉米第6号染色体上，其在b73中的基因组核苷酸序列如seq id no:1所示，cds序列如seq id no:2所示，氨基酸序列如seq id no:3所示。上述所提到的雄性育性基因可从种植物中分离获得。本领域技术人员应该知晓，本专利技术所述的雄性育性恢复基因包括与zmms2085基因高度同源，并且具有同样的雄性育性调控功能的高度同源的功能等价序列。所述高度同源的功能等价序列包括在严谨条件下能够与本专利技术所公开的zmms2085基因的核苷酸序列杂交的dna序列。
4、本专利技术中所使用的“严谨条件”是公知的，包括诸如在含400mm nacl、40mm pipes(ph6.4)和l mm edta的杂交液中于60℃杂交12-16小时，然后在65℃下用含0.1％sds、和0.1×ssc的洗涤液洗涤15-60分钟。
5、功能等价序列还包括与本专利技术所公开的zmms2085基因所示的序列有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％序列相似性，且具有雄性育性调控功能的dna序列，可以从任何植物中分离获得。其中，序列相似性的百分比可以通过公知的生物信息学算法来获得，包括myers和miller算法(bioinformatics，4(1)：1117，1988)、needleman-wunsch全局比对法(j mol biol，48(3)：443-453，1970)、smith-waterman局部比对法(j mol biol，147：195-197，1981)、pearson和lipman相似性搜索法(pnas，85(8)：2444-2448，1988)、karlin和altschul的算法(altschul等，j mol biol，215(3)：403-410，1990；pnas，90：5873-5877，1993)。这对于本领域技术人员来说是熟悉的。
6、基于上述发现，第一方面，本专利技术提供用于调控植物雄性育性的核苷酸片段，所述核苷酸片段为以下任一：
7、(1)具有seq id no:1所示的核苷酸序列；
8、(2)具有seq id no:2所示的核苷酸序列；
9、(3)在严格条件下能够与(1)-(2)中任一核苷酸序列杂交的核苷酸序列；或
10、(4)与(1)-(3)之任一所述核苷酸序列互补的片段；或
11、(5)在(1)-(3)之任一所述核苷酸序列的基础之上，经过一至数个碱基替换和/或一至数个碱基的插入和/或缺失以及大片段的核苷酸序列插入/缺失/易位/倒位所形成能够影响植物雄性器官生育能力的片段；或
12、(6)与(1)-(3)之任一所述核苷酸序列具有85％以上的同一性且编码玉米雄性育性相关蛋白的片段。
13、本专利技术提供上述核苷酸片段编码的蛋白，所述蛋白为以下任一：
14、1)所述蛋白的氨基酸序列如seq id no:3所示；
15、2)所述蛋白为：将seq id no:3经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有调控植物雄性育性活性的蛋白。
16、本专利技术提供一种生物材料，含有上述的核苷酸片段；所本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.用于调控植物雄性育性的核苷酸片段，其特征在于，所述核苷酸片段为以下任一：
2.权利要求1所述的核苷酸片段编码的蛋白，其特征在于，所述蛋白为以下任一：
3.一种生物材料，其特征在于，含有权利要求1所述的核苷酸片段；所述生物材料为表达盒，表达载体、工程菌、或转基因细胞系，所述转基因细胞系不能繁殖为植物。
4.一种突变体，含有所述突变体的植株表现为雄性不育，其特征在于，所述突变体的核苷酸序列为：以如SEQ ID NO:1或2任一所示的核苷酸序列进行突变获得；
5.根据权利要求4所述的突变体，其特征在于，制备所述的突变体的方法包括：采用CRISPR-Cas9方法，以靶位点1的序列：TCGATGTCCCTATGAAGCTC和/或靶位点2的序列：AGGAGCTAGCTTCTGGTCGG为靶位点，造成靶位点或靶位点及相邻核苷酸序列突变，得到所述突变体；
6.根据权利要求5所述的突变体，其特征在于，所述突变体为在玉米基因组版本Zm-B73-REFERENCE-NAM-5.0第6号染色体第14747788位碱基后插入了GA两个碱基；优
7.一种适用于CRISPR/Cas9系统对植物ZmMS2085基因进行定向敲除的靶位点，其特征在于，所述靶位点包括：靶位点1：TCGATGTCCCTATGAAGCTC和/或靶位点2的序列：AGGAGCTAGCTTCTGGTCGG。
8.特异性靶向权利要求7所述靶位点的sgRNA。
9.含有权利要求8所述sgRNA的DNA序列的CRISPR/Cas9打靶载体。
10.权利要求1所述的核苷酸片段或其编码蛋白或含有其的生物材料或DNA分子或权利要求4-6任一所述的突变体或权利要求7所述的靶位点或权利要求8所述的sgRNA或权利要求9所述的CRISPR/Cas9打靶载体在以下任一项中的应用：
...【技术特征摘要】
1.用于调控植物雄性育性的核苷酸片段，其特征在于，所述核苷酸片段为以下任一：
2.权利要求1所述的核苷酸片段编码的蛋白，其特征在于，所述蛋白为以下任一：
3.一种生物材料，其特征在于，含有权利要求1所述的核苷酸片段；所述生物材料为表达盒，表达载体、工程菌、或转基因细胞系，所述转基因细胞系不能繁殖为植物。
4.一种突变体，含有所述突变体的植株表现为雄性不育，其特征在于，所述突变体的核苷酸序列为：以如seq id no:1或2任一所示的核苷酸序列进行突变获得；
5.根据权利要求4所述的突变体，其特征在于，制备所述的突变体的方法包括：采用crispr-cas9方法，以靶位点1的序列：tcgatgtccctatgaagctc和/或靶位点2的序列：aggagctagcttctggtcgg为靶位点，造成靶位点或靶位点及相邻核苷酸序列突变，得到所述突变体；
6.根据权利要求5所述的突变体，其特征在于，所述突变体为在玉米基因组版本z...
【专利技术属性】
技术研发人员：李京琳，李新鹏，董叶红，吴群珠，曾翔，吴永忠，黄培劲，
申请(专利权)人：海南波莲水稻基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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