【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及关于类黄酮、花青素和其它有机化合物的产生的材料(包含经工程化的细胞和细胞系)和方法。
技术介绍
1、类黄酮和花青素是在植物中产生的天然产物，被发现具有多种作用，如抗氧化剂、紫外线(uv)防御机制和颜色。在过去的若干年中，类黄酮和花青素的健康益处已被广泛证明。这些化合物能够清除自由基，并且可以作为酶抑制剂和抗炎剂。由于这些公认的健康和颜色益处，许多研究已进行了解这些化合物是如何在自然界中制成的。类黄酮和花青素由苯丙素起始单元和丙二酰辅因子-a(丙二酰-coa)扩展单元合成，然后进行修饰以产生许多多酚化合物，如花旗松素、柚皮素和(+)-儿茶素。然而，在大多数情况下，这些化合物是经提取或化学制造的。
技术实现思路
1、为了摆脱农业和化学衍生产品，已创造了用于类黄酮和花青素的生物产生的经工程化的细胞。此方法提供了用于快速、安全、经济和可持续地产生各种各样的重要类黄酮的可行途径。
2、在本文中，一系列类黄酮和花青素，包含柚皮素、圣草酚、花旗松素、二氢山奈酚、(+)-儿茶素、矢车菊素和矢车菊素-3-葡萄糖苷，被使用经修饰的微生物宿主进行生物制备。在本文中，该经工程化的细胞包含一种或多种基因修饰，该一种或多种基因修饰通过增加类黄酮前体的代谢通量和/或减少由副产物的产生引起的碳损失来增加类黄酮和花青素的生物产生。
3、本文提供了经工程化以用于产生类黄酮、花青素和其它有机化合物的细胞，其中经工程化的细胞包含一种或多种基因修饰，该一种或多种基因修饰通过增加类黄酮前
4、还提供了用于产生一种或多种类黄酮或花青素的细胞培养物。该细胞培养物包含在培养基中的如本文所提供的经工程化的细胞，该培养基包含也能够是能量源的碳源，如甘油、糖或有机酸。在各种实施例中，该培养基可以包含至少一种养料分子，如但不限于一种或多种有机酸或氨基酸，该一种或多种有机酸或氨基酸可以转化成类黄酮前体(如酪氨酸、对香豆酰-coa或丙二酰-coa)。养料分子的实例包含但不限于乙酸盐、丙二酸盐、丙二酸盐、酪氨酸、苯丙氨酸、泛酸盐、香豆酸盐等。在一些实施例中，养料分子可以被减少或是低纯度的。例如，作为养料分子的甘油可以是粗甘油，该粗甘油包含包括甘油的生物质，例如，作为生物柴油加工的副产物获得的甘油。可替代地，或另外地，该培养基可以包含补体化合物，该补体化合物可以是由在类黄酮途径中起作用的酶使用的辅因子或辅因子的前体，如碳酸氢盐、生物素、硫胺素、泛酸盐、α-酮戊二酸盐、抗坏血酸盐或5-氨基乙酰丙酸。
5、另外提供了用于产生类黄酮和花青素的方法，该方法包含培养细胞，该细胞经工程化用于在其中细胞产生类黄酮或花青素的情况下，产生如本文所述的类黄酮或花青素。在一些实例中，该方法包含在培养基中培养经工程化的细胞，该培养基包含至少一种养料分子或补体，如但不限于：酪氨酸、苯丙氨酸、丙二酸盐、对香豆酸盐、碳酸氢盐、乙酸盐、泛酸盐、生物素、硫胺素、α-酮戊二酸盐、抗坏血酸盐和5-氨基乙酰丙酸。该方法可以进一步包含从培养基、全培养物或该细胞恢复类黄酮中的至少一种。
6、第一方面，本文提供了被工程化以产生一种或多种类黄酮或花青素的细胞，其中该细胞除了编码酪氨酸解氨酶活性和/或苯丙氨酸解氨酶活性和肉桂酸-4-羟化酶活性、4-香豆酸-coa连接酶活性、查耳酮合成酶活性、查耳酮异构酶活性、黄烷酮-3-羟化酶活性、类黄酮-3'-羟化酶活性或类黄酮3'5'-羟化酶活性、细胞色素p450还原酶活性、无色花色素还原酶活性和二氢黄酮醇-4-还原酶活性的核酸序列之外，包含一种或多种基因修饰用于提高类黄酮或花青素的产生。如本文所示，经工程化以产生类黄酮中的一种或多种的细胞被工程化以包含：编码酪氨酸解氨酶活性的外源核酸序列，该外源核酸序列可以使用酪氨酸作为底物形成4-香豆酸(例如，酪氨酸解氨酶tal，ec：4.3.1.25)；或者可替代地或另外地，编码苯丙氨酸解氨酶活性的外源核酸序列，该外源核酸序列可以将苯丙氨酸转化成反式肉桂酸；以及编码肉桂酸-4-羟化酶活性的外源核酸序列，由肉桂酸形成4-香豆酸；编码coa连接酶活性的外源核酸序列，该外源核酸序列由香豆酸形成对香豆酰-coa(例如，4-香豆酸—coa连接酶，4cl，ec：6.2.1.12)；编码聚酮合成酶活性的外源核酸序列，该外源核酸序列使用丙二酰-coa和对香豆酰-coa作为底物形成柚皮素查耳酮(例如，查耳酮合成酶，chs，ec：2.3.1.74)；编码查耳酮异构酶活性的外源核酸序列，该外源核酸序列通过其环化酶活性由柚皮素查耳酮形成柚皮素(例如，查耳酮-二氢黄酮异构酶，chi，ec:5.5.1.6)；编码黄烷酮-3-羟化酶活性的外源核酸序列，该外源核酸序列由柚皮素形成二氢山奈酚或由圣草酚形成花旗松素(例如，柚皮素3-双加氧酶，f3h，ec：1.14.11.9)；编码类黄酮3'-羟化酶或类黄酮3'5'-羟化酶活性的外源核酸序列，该外源核酸序列与编码细胞色素p450还原酶活性的外源核酸序列偶联以由二氢山奈酚形成花旗松素或二氢杨梅素或由柚皮素形成圣草酚或五羟基黄酮(例如，类黄酮3'-单加氧酶f3'h，ec：1.14.13.21，ec：1.14.14.82；细胞色素p450/nadph--p450还原酶，ec：1.14.14.1；f3'5'h，ec:1.14.14.81)；编码二氢黄酮醇-4-还原酶活性的外源核酸序列，该外源核酸序列由花旗松素形成白矢车菊素，由二氢杨梅素形成白飞燕草素或者由二氢山奈酚形成白天竺葵苷元(例如，二氢黄酮醇-4-还原酶，ec：1.1.1)；以及编码无色花色素还原酶活性的外源核酸序列，该外源核酸序列由白矢车菊素形成儿茶素(例如，无色花色素还原酶，lar，ec：1.17.1.3)。任选地，经工程化以产生花青素的细胞被进一步工程化以包含编码花青素合成酶活性的外源核酸序列，该外源核酸序列由儿茶素或白矢车菊素形成矢车菊素，由白飞燕草素形成飞燕草素或由白天竺葵苷元形成天竺葵素(例如，花青素合成酶，ans，ec：1.14.20.4)以及包含编码葡糖基转移酶活性的外源核酸序列，该外源核酸序列由矢车菊素形成矢车菊素-3-o-β-d-葡萄糖苷，该外源核酸序列由飞燕草素形成飞燕草素-3-o-β-d-葡萄糖苷或者由天竺葵素形成天竺葵素-3-o-β-d-葡萄糖苷(例如，花青素3-o-葡糖基转移酶，3gt，ec：2.4.1.115)。本文提供的经工程化以产生类黄酮或花青素的细胞被进一步工程化以增加类黄酮或花青素产物的产生，例如通过增加类黄酮或花青素途径的代谢通量，或者通过降低副产物形成。
7、经工程化以产生类黄酮的细胞被进一步工程化以增加前体丙二酰-coa的供应。用于增加丙二酰-coa的一种策略包含增加乙酰-co本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种经工程化的宿主细胞，其包括一种或多种基因修饰，所述一种或多种基因修饰使得由所述经工程化的宿主细胞通过多种化学中间体从也能够是能量源的碳源产生类黄酮或花青素。
2.根据权利要求1所述的经工程化的宿主细胞，其中所述从也能够是能量源的碳源产生类黄酮或花青素通过酶促转化发生。
3.根据权利要求1所述的经工程化的宿主细胞，其中所述碳源选自由以下组成的组：(i)甘油；(ii)糖；(iii)有机酸；(iv)氨基酸；(v)包括甘油的生物质；以及(vi)其任何组合。
4.根据权利要求1所述的经工程化的宿主细胞，其中所述经工程化的宿主细胞在包括选自由以下组成的组的分子的培养基中培养：(i)甘油；(ii)糖；(iii)有机酸；(iv)氨基酸；(v)包括甘油的生物质；以及(vi)其任何组合。
5.根据权利要求1所述的经工程化的宿主细胞，其中所述一种或多种基因修饰使得类黄酮前体或辅因子的代谢通量增加。
6.根据权利要求1所述的经工程化的宿主细胞，其中所述一种或多种基因修饰使得副产物的形成减少。
7.根据权利要求1所述的经工程化
8.根据权利要求1所述的经工程化的宿主细胞，其中所述经工程化的宿主细胞在包括选自由以下组成的组的分子的培养基中培养：酪氨酸、苯丙氨酸、丙二酸盐、对香豆酸盐、碳酸氢盐、乙酸盐、泛酸盐、生物素、硫胺素、α-酮戊二酸盐、抗坏血酸盐和5-氨基乙酰丙酸。
9.根据权利要求1所述的经工程化的宿主细胞，其中所述经工程化的宿主细胞包括选自由以下组成的组的至少一种或多种核酸序列：(i)编码酪氨酸解氨酶活性的核酸序列；(ii)编码苯丙氨酸解氨酶活性的核酸序列；(iii)编码肉桂酸4-羟化酶活性的核酸序列；(iv)编码4-香豆酸-CoA连接酶(4CL)活性的核酸序列；以及(v)其任何组合。
10.根据权利要求1所述的经工程化的宿主细胞，其中所述经工程化的宿主细胞包括选自由以下组成的组的至少一种或多种肽：(i)查耳酮异构酶；(ii)查耳酮合成酶；(iii)融合蛋白包括查耳酮合成酶和查耳酮异构酶；以及(iv)其任何组合。
11.根据权利要求1所述的经工程化的宿主细胞，其中所述经工程化的宿主细胞是大肠杆菌(E.coli.)。
12.根据权利要求1所述的经工程化的宿主细胞，其中所述一种或多种基因修饰减少脂肪酸生物合成。
13.根据权利要求1所述的经工程化的宿主细胞，其中所述经工程化的宿主细胞包括选自由以下组成的组的外源核酸序列：(i)编码酪氨酸解氨酶的核酸序列，其中所编码的酪氨酸解氨酶使用酪氨酸作为底物形成4-香豆酸；(ii)编码苯丙氨酸解氨酶的核酸序列，其中所编码的苯丙氨酸解氨酶将苯丙氨酸转化为反式肉桂酸；(iii)编码肉桂酸4-羟化酶的核酸序列，其中所述肉桂酸4-羟化酶由反式肉桂酸产生4-香豆酸；(iv)编码4-香豆酸-CoA连接酶活性的核酸序列，其中4-香豆酸-CoA连接酶由香豆酸形成对香豆酰-CoA；(v)编码查耳酮合成酶活性的核酸序列，其中查耳酮合成酶由丙二酰-CoA和对香豆酰-CoA形成柚皮素查耳酮；(vi)编码查耳酮异构酶活性的核酸序列，其中查耳酮异构酶由柚皮素查耳酮形成柚皮素；(vii)编码黄烷酮-3-羟化酶的核酸序列，其中黄烷酮-3-羟化酶由柚皮素形成二氢山奈酚；以及(viii)其任何组合。
14.根据权利要求1所述的经工程化的宿主细胞，其中所述类黄酮是儿茶素。
15.一种增加类黄酮或花青素的产生的方法，所述方法包括：提供经工程化的宿主细胞，所述经工程化的宿主细胞包括一种或多种基因修饰，所述一种或多种基因修饰使得由所述经工程化的宿主细胞通过多种化学中间体从也能够是能量源的碳源产生类黄酮或花青素。
16.根据权利要求15所述的方法，其中从甘油产生类黄酮或花青素通过酶促转化发生。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述碳源选自由以下组成的组：(i)甘油；(ii)糖；(iii)有机酸；(iv)氨基酸；(v)包括甘油的生物质；以及(vi)其任何组合。
18.根据权利要求15所述的方法，其中所述经工程化的宿主细胞在包括选自由以下组成的组的分子的培养基中培养：(i)甘油；(ii)糖；(iii)有机酸；...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种经工程化的宿主细胞，其包括一种或多种基因修饰，所述一种或多种基因修饰使得由所述经工程化的宿主细胞通过多种化学中间体从也能够是能量源的碳源产生类黄酮或花青素。
2.根据权利要求1所述的经工程化的宿主细胞，其中所述从也能够是能量源的碳源产生类黄酮或花青素通过酶促转化发生。
3.根据权利要求1所述的经工程化的宿主细胞，其中所述碳源选自由以下组成的组：(i)甘油；(ii)糖；(iii)有机酸；(iv)氨基酸；(v)包括甘油的生物质；以及(vi)其任何组合。
4.根据权利要求1所述的经工程化的宿主细胞，其中所述经工程化的宿主细胞在包括选自由以下组成的组的分子的培养基中培养：(i)甘油；(ii)糖；(iii)有机酸；(iv)氨基酸；(v)包括甘油的生物质；以及(vi)其任何组合。
5.根据权利要求1所述的经工程化的宿主细胞，其中所述一种或多种基因修饰使得类黄酮前体或辅因子的代谢通量增加。
6.根据权利要求1所述的经工程化的宿主细胞，其中所述一种或多种基因修饰使得副产物的形成减少。
7.根据权利要求1所述的经工程化的宿主细胞，其中所述一种或多种基因修饰是选自由以下组成的组的至少一种基因修饰：(i)用于在所述经工程化的宿主细胞中过表达一种或多种内源基因的一种或多种修饰；(ii)用于在所述经工程化的宿主细胞中低表达一种或多种内源基因的一种或多种修饰；(iii)一种或多种基因修饰在所述经工程化的宿主细胞中表达一种或多种非天然基因；以及(iv)其任何组合。
8.根据权利要求1所述的经工程化的宿主细胞，其中所述经工程化的宿主细胞在包括选自由以下组成的组的分子的培养基中培养：酪氨酸、苯丙氨酸、丙二酸盐、对香豆酸盐、碳酸氢盐、乙酸盐、泛酸盐、生物素、硫胺素、α-酮戊二酸盐、抗坏血酸盐和5-氨基乙酰丙酸。
9.根据权利要求1所述的经工程化的宿主细胞，其中所述经工程化的宿主细胞包括选自由以下组成的组的至少一种或多种核酸序列：(i)编码酪氨酸解氨酶活性的核酸序列；(ii)编码苯丙氨酸解氨酶活性的核酸序列；(iii)编码肉桂酸4-羟化酶活性的核酸序列；(iv)编码4-香豆酸-coa连接酶(4cl)活性的核酸序列；以及(v)其任何组合。
10.根据权利要求1所述的经工程化的宿主细胞，其中所述经工程化的宿主细胞包括选自由以下组成的组的至少一种或多种肽：(i)查耳酮异构酶；(ii)查耳酮合成酶；(iii)融合蛋白包括查耳酮合成酶和查耳酮异构酶；以及(iv)其任何组合。
11.根据权利要求1所述的经工程化的宿主细胞，其中所述经工程化的宿主细胞是大肠杆菌(e.coli.)。
12.根据权利要求1所述的经工程化的宿主细胞，其中所述一种或多种基因修饰减少脂肪酸生物合成。
13.根据权利要求1所述的经工程化的宿主细胞，其中所述经工程化的宿主细胞包括选自由以下组成的组的外源核酸序列：(i)编码酪氨酸解氨酶的核酸序列，其中所编码的酪氨酸解氨酶使用酪氨酸作为底物形成4-香豆酸；(ii)编码苯丙氨酸解氨酶的核酸序列，其中所编码的苯丙氨酸解氨酶将苯丙氨酸转化为反式肉桂酸；(iii)编码肉桂酸4-羟化酶的核酸序列，其中所述肉桂酸4-羟化酶由反式肉桂酸产生4-香豆酸；(iv)编码4-香豆酸-coa连接酶活性的核酸序列，其中4-香豆酸-coa连接酶由香豆酸形成对香豆酰-coa；(v)编码查耳酮合成酶活性的核酸序列，其中查耳酮合成酶由丙二酰-coa和对香豆酰-coa形成柚皮素查耳酮；(vi)编码查耳酮异构酶活性的核酸序列，其中查耳酮异构酶由柚皮素查耳酮形成柚皮素；(vii)编码黄烷酮-3-羟化酶的核酸序列，其中黄烷酮-3-羟化酶由柚皮素形成二氢山奈酚；以及(viii)其任何组合。
14.根据权利要求1所述的经工程化的宿主细胞，其中所述类黄酮是儿茶素。
15.一种增加类黄酮或花青素的产生的方法，所述方法包括：提供经工程化的宿主细胞，所述经工程化的宿主细胞包括一种或多种基因修饰，所述一种或多种基因修饰使得由所述经工程化的宿主细胞通过多种化学中间体从也能够是能量源的碳源产生类黄酮或花青素。
16.根据权利要求15所述的方法，其中从甘油产生类黄酮或花青素通过酶促转化发生。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述碳源选自由以下组成的组：(i)甘油；(ii)糖；(iii)有机酸；(iv)氨基酸；(v)包括甘油的生物质；以及(vi)其任何组合。
18.根据权利要求15所述的方法，其中所述经工程化的宿主细胞在包括选自由以下组成的组的分子的培养基中培养：(i)甘油；(ii)糖；(iii)有机酸；(iv)氨基酸；(v)包括甘油的生物质；以及(vi)其任何组合。
19.根据权利要求15所述的方法，其中所述一种或多种基因修饰使得类黄酮前体或辅因子的代谢通量增加。
20.根据权利要求15所述的方法，其中所述一种或多种基因修饰使得副产物的产生减少。
21.根据权利要求15所述的方法，其中所述一种或多种基因修饰是选自由以下组成的组的至少一种基因修饰：(i)用于在所述经工程化的宿主细胞中过表达一种或多种内源基因的一种或多种修饰；(ii)用于在所述经工程化的宿主细胞中低表达一种或多种内源基因的一种或多种修饰；(iii)用于在所述经工程化的宿主细胞中表达一种或多种非天然基因的一种或多种基因修饰；以及(iv)其任何组合。
22.根据权利要求15所述的方法，其中所述经工程化的宿主细胞在包括选自由以下组成的组的分子的培养基中培养：酪氨酸、苯丙氨酸、丙二酸盐、对香豆酸盐、碳酸氢盐、乙酸盐、泛酸盐、生物素、硫胺素、α-酮戊二酸盐、抗坏血酸盐和5-氨基乙酰丙酸。
23.根据权利要求15所述的方法，其中所述经工程化的宿主细胞包括选自由以下组成的组的至少一种或多种核酸序列：(i)编码酪氨酸解氨酶活性的核酸序列；(ii)编码苯丙氨酸解氨酶活性的核酸序列；(iii)编码肉桂酸4-羟化酶活性的核酸序列；(iv)编码4-香豆酸-coa连接酶(4cl)活性的核酸序列；以及(v)其任何组合。
24.根据权利要求15所述的方法，其中所述经工程化的宿主细胞包括选自由以下组成的组的至少一种或多种肽：(i)查耳酮异构酶；(ii)查耳酮合成酶；(iii)融合蛋白包括查耳酮合成酶和查耳酮异构酶；以及(iv)其任何组合。
25.根据权利要求15所述的方法，其中所述经工程化的宿主细胞是大肠杆菌。
26.根据权利要求15所述的方法，其中所述一种或多种基因修饰减少脂肪酸生物合成。
27.根据权利要求15所述的方法，其中所述经工程化的宿主细胞包括选自由以下组成的组的外源核酸序列：(i)编码酪氨酸解氨酶的核酸序列，其中所编码的酪氨酸解氨酶使用酪氨酸作为底物形成4-香豆酸；(ii)编码苯丙氨酸解氨酶的核酸序列，其中所编码的苯丙氨酸解氨酶将苯丙氨酸转化为反式肉桂酸；(iii)编码肉桂酸4-羟化酶的核酸序列，其中所述肉桂酸4-羟化酶由反式肉桂酸产生4-香豆酸；(iv)编码4-香豆酸-coa连接酶活性的核酸序列，其中4-香豆酸-coa连接酶由香豆酸形成对香豆酰-coa；(v)编码查耳酮合成酶活性的核酸序列，其中查耳酮合成酶由丙二酰-coa和对香豆酰-coa形成柚皮素查耳酮；(vi)编码查耳酮异构酶活性的核酸序列，其中查耳酮异构酶由柚皮素查耳酮形成柚皮素；(vii)编码黄烷酮-3-羟化酶的核酸序列，其中黄烷酮-3-羟化酶由柚皮素形成二氢山奈酚；以及(viii)其任何组合。
28.根据权利要求15所述的方法，其中所述类黄酮是儿茶素。
29.多个经工程化的宿主细胞，其中多个所述经工程化的宿主细胞中的每一个包括一种或多种基因修饰，所述一种或多种基因修饰使得由所述经工程化的宿主细胞通过多种化学中间体从也能够是能量源的碳源产生类黄酮或花青素。
30.根据权利要求29所述的多个经工程化的宿主细胞，其中从甘油产生类黄酮或花青素通过酶促转化发生。
31.根据权利要求29所述的多个经工程化的宿主细胞，其中所述碳源选自由以下组成的组：(i)甘油；(ii)糖；(iii)有机酸；(iv)氨基酸；(v)包括甘油的生物质；以及(vi)其任何组合。
32.根据权利要求29所述的多个经工程化的宿主细胞，其中所述经工程化的宿主细胞在包括选自由以下组成的组的分子的培养基中培养：(i)甘油；(ii)糖；(iii)有机酸；(iv)氨基酸；(v)包括甘油的生物质；以及(vi)其任何组合。
33.根据权利要求29所述的多个经工程化的宿主细胞，其中所述一种或多种基因修饰使得类黄酮前体或辅因子的代谢通量增加。
34.根据权利要求29所述的多个经工程化的宿主细胞，其中所述一种或多种基因修饰使得副产物的形成减少。
35.根据权利要求29所述的多个经工程化的宿主细胞，其中所述一种或多种基因修饰是选自由以下组成的组的至少一种基因修饰：(i)用于在所述经工程化的宿主细胞中过表达一种或多种内源基因的一种或多种修饰；(ii)用于在所述经工程化的宿主细胞中低表达一种或多种内源基因的一种或多种修饰；(iii)一种或多种基因修饰在所述经工程化的宿主细胞中表达一种或多种非天然基因；以及(iv)其任何组合。
36.根据权利要求29所述的多个经工程化的宿主细胞，其中所述经工程化的宿主细胞中的至少一个在包括选自由以下组成的组的分子的培养基中培养：酪氨酸、苯丙氨酸、丙二酸盐、对香豆酸盐、碳酸氢盐、乙酸盐、泛酸盐、生物素、硫胺素、α-酮戊二酸盐、抗坏血酸盐和5-氨基乙酰丙酸。
37.根据权利要求29所述的多个经工程化的宿主细胞，其中所述经工程化的宿主细胞中的至少一个包括选自由以下组成的组的至少一种或多种核酸序列：(i)编码酪氨酸解氨酶活性的核酸序列；(ii)编码苯丙氨酸解氨酶活性的核酸序列；(iii)编码肉桂酸4-羟化酶活性的核酸序列；(iv)编码4-香豆酸-coa连接酶(4cl)活性的核酸序列；以及(v)其任何组合。
38.根据权利要求29所述的多个经工程化的宿主细胞，其中所述经工程化的宿主细胞中的至少一个包括选自由以下组成的组的至少一种或多种肽：(i)查耳酮异构酶；(ii)查耳酮合成酶；(iii)融合蛋白包括查耳酮合成酶和查耳酮异构酶；以及(iv)其任何组合。
39.根据权利要求29所述的多个经工程化的宿主细胞，其中所述经工程化的宿主细胞中的至少一个是大肠杆菌。
40.根据权利要求29所述的多个经工程化的宿主细胞，其中所述一种或多种基因修饰减少脂肪酸生物合成。
41.根据权利要求29所述的多个经工程化的宿主细胞，其中所述经工程化的宿主细胞中的至少一个包括选自由以下组成的组的外源核酸序列：(i)编码酪氨酸解氨酶的核酸序列，其中所编码的酪氨酸解氨酶使用酪氨酸作为底物形成4-香豆酸；(ii)编码苯丙氨酸解氨酶的核酸序列，其中所编码的苯丙氨酸解氨酶将苯丙氨酸转化为反式肉桂酸；(iii)编码肉桂酸4-羟化酶的核酸序列，其中所述肉桂酸4-羟化酶由反式肉桂酸产生4-香豆酸；(iv)编码4-香豆酸-coa连接酶活性的核酸序列，其中4-香豆酸-coa连接酶由香豆酸形成对香豆酰-coa；(v)编码查耳酮合成酶活性的核酸序列，其中查耳酮合成酶由丙二酰-coa和对香豆酰-coa形成柚皮素查耳酮；(vi)编码查耳酮异构酶活性的核酸序列，其中查耳酮异构酶由柚皮素查耳酮形成柚皮素；(vii)编码黄烷酮-3-羟化酶的核酸序列，其中黄烷酮-3-羟化酶由柚皮素形成二氢山奈酚；以及(viii)其任何组合。
42.根据权利要求29所述的多个经工程化的宿主细胞，其中所述类黄酮是儿茶素。
43.一种增加类黄酮或花青素的产生的方法，所述方法包括：提供多个经工程化的宿主细胞，其中所述多个经工程化的宿主细胞中的每一个包括一种或多种基因修饰，所述一种或多种基因修饰使得由所述经工程化的宿主细胞通过多种化学中间体通过多种化学中间体从也能够是能量源的碳源产生类黄酮或花青素。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述一种或多种基因修饰使得类黄酮前体的代谢通量增加。
45.根据权利要求43所述的方法，其中所述碳源选自由以下组成的组：(i)甘油；(ii)糖；(iii)有机酸；(iv)氨基酸；(v)包括甘油的生物质；以及(vi)其任何组合。
46.根据权利要求43所述的方法，其中所述经工程化的宿主细胞在包括选自由以下组成的组的分子的培养基中培养：(i)甘油；(ii)糖；(iii)有机酸；(iv)氨基酸；(v)包括甘油的生物质；以及(vi)其任何组合。
47.根据权利要求43所述的方法，其中所述一种或多种基因修饰使得类黄酮前体或辅因子的代谢通量增加。
48.根据权利要求43所述的方法，其中所述一种或多种基因修饰使得副产物的产生减少。
49.根据权利要求43所述的方法，其中所述一种或多种基因修饰是选自由以下组成的组的至少一种基因修饰：(i)用于在所述经工程化的宿主细胞中过表达一种或多种内源基因的一种或多种修饰；(ii)用于在所述经工程化的宿主细胞中低表达一种或多种内源基因的一种或多种修饰；(iii)一种或多种基因修饰在所述经工程化的宿主细胞中表达一种或多种非天然基因；以及(iv)其任何组合。
50.根据权利要求43所述的方法，其中所述经工程化的宿主细胞中的至少一个在包括选自由以下组成的组的分子的培养基中培养：酪氨酸、苯丙氨酸、丙二酸盐、对香豆酸盐、碳酸氢盐、乙酸盐、泛酸盐、生物素、硫胺素、α-酮戊二酸盐、抗坏血酸盐和5-氨基乙酰丙酸。
51.根据权利要求43所述的方法，其中所述经工程化的宿主细胞中的至少一个包括选自由以下组成的组的至少一种或多种核酸序列：(i)编码酪氨酸解氨酶活性的核酸序列；(ii)编码苯丙氨酸解氨酶活性的核酸序列；(iii)编码肉桂酸4-羟化酶活性的核酸序列；(iv)编码4-香豆酸-coa连接酶(4cl)活性的核酸序列；以及(v)其任何组合。
52.根据权利要求43所述的方法，其中所述经工程化的宿主细胞中的至少一个包括选自由以下组成的组的至少一种或多种肽：(i)查耳酮异构酶；(ii)查耳酮合成酶；(iii)融合蛋白包括查耳酮合成酶和查耳酮异构酶；以及(iv)其任何组合。
53.根据权利要求43所述的方法，其中所述经工程化的宿主细胞中的至少一个是大肠杆菌。
54.根据权利要求43所述的方法，其中所述一种或多种基因修饰减少脂肪酸生物合成。
55.根据权利要求43所述的方法，其中所述经工程化的宿主细胞中的至少一个包括选自由以下组成的组的外源核酸序列：(i)编码酪氨酸解氨酶的核酸序列，其中所编码的酪氨酸解氨酶使用酪氨酸作为底物形成4-香豆酸；(ii)编码苯丙氨酸解氨酶的核酸序列，其中所编码的苯丙氨酸解氨酶将苯丙氨酸转化为反式肉桂酸；(iii)编码肉桂酸4-羟化酶的核酸序列，其中所述肉桂酸4-羟化酶由反式肉桂酸产生4-香豆酸；(iv)编码4-香豆酸-coa连接酶活性的核酸序列，其中4-香豆酸-coa连接酶由香豆酸形成对香豆酰-coa；(v)编码查耳酮合成酶活性的核酸序列，其中查耳酮合成酶由丙二酰-coa和对香豆酰-coa形成柚皮素查耳酮；(vi)编码查耳酮异构酶活性的核酸序列，其中查耳酮异构酶由柚皮素查耳酮形成柚皮素；(vii)编码黄烷酮-3-羟化酶的核酸序列，其中黄烷酮-3-羟化酶由柚皮素形成二氢山奈酚；以及(viii)其任何组合。
56.根据权利要求43所述的方法，其中所述类黄酮是儿茶素。
57.一种经工程化的宿主细胞，其中所述经工程化的宿主细胞包括一种或多种基因修饰以增加丙二酰-coa的产生和/或可得性。
58.根据权利要求57所述的经工程化的宿主细胞，其中所述丙二酰-coa的产生和/或可得性通过使乙酰-coa转化成丙二酰-coa来增加。
59.根据权利要求57所述的经工程化的宿主细胞，其中所述经工程化的宿主细胞包括选自由以下组成的组的一种或多种基因修饰：(i)乙酰-coa羧化酶(acc)的表达；和(ii)乙酰-coa羧化酶的过表达。
60.根据权利要求57所述的经工程化的宿主细胞，其中所述经工程化的宿主细胞是大肠杆菌。
61.根据权利要求60所述的经工程化的宿主细胞，其中所述大肠杆菌进一步包括来自真菌的基因。
62.根据权利要求59所述的经工程化的宿主细胞，其中所述乙酰-coa羧化酶来自选自由卷枝毛霉菌(mucor circinelloides)、圆红酵母(rhodotorula toruloides)、斯达氏油脂酵母(lipomyces starkeyi)和玉米黑粉菌(ustilago maydis)组成的组的物种，以及与上述提及的这些物种的乙酰-coa羧化酶具有至少50％氨基酸同一性的乙酰-coa羧化酶的直系同源物。
63.根据权利要求57所述的经工程化的宿主细胞，其中所述一种或多种基因修饰是一种或多种脂肪生物合成基因的缺失或衰减，从而使得脂肪酸生物合成减少。
64.根据权利要求57所述的经工程化的宿主细胞，其中所述一种或多种基因修饰是乙酰-coa合成酶(acs)的过表达。
65.根据权利要求64所述的经工程化的宿主细胞，其中所述乙酰-coa合成酶选自由以下组成的组：大肠杆菌的乙酰-coa合成酶基因、鼠伤寒沙门氏菌(salmonellatyphimurium)的乙酰-coa合成酶基因以及任何其它物种中的与大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌的所述乙酰-coa合成酶基因具有至少50％氨基酸同一性的乙酰-coa合成酶基因的直系同源物。
66.根据权利要求57所述的经工程化的宿主细胞，其中所述一种或多种基因修饰选自由以下组成的组：(i)编码丙酮酸盐脱氢酶(pdh)的基因的过表达，其中所述pdh能够包含e354k突变；(ii)编码丙二酰-coa合成酶的外源核酸序列：(iii)内源泛酸激酶(pank)的上调，其中pank不被辅酶a反馈抑制；(iv)编码丙二酸盐转运子的外源核酸序列；以及(v)其任何组合。
67.根据权利要求66所述的经工程化的宿主细胞，其中所述丙二酰-coa合成酶选自由以下组成的组：天蓝色链霉菌(streptomyces coelicolor)、沼泽红假单胞菌(rhodopseudomonaspalustris)的丙二酰-coa合成酶或与这些或其它天然存在的丙二酰-coa合成酶中的任一个具有至少50％同一性的丙二酰-coa合成酶。
68.根据权利要求63所述的经工程化的宿主细胞，其中所述其中用于减少脂肪酸生物合成的一种或多种基因修饰选自由以下组成的组：(i)编码丙二酰-coa-acp转酰酶(大肠杆菌fabd)的基因的突变...
【专利技术属性】
技术研发人员：李静怡，N·布里多，J·布里顿，E·霍尔茨阿普尔，
申请(专利权)人：德比生物技术公司，
类型：发明
国别省市：
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