【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学，具体涉及一种pnpla2基因缺失斑马鱼突变体的制备方法及其应用。
技术介绍
1、鱼类主要的可食用部分是肌肉。肌肉脂质的积累情况与鱼肉的营养价值和鱼肉品质密切相关。大量研究表明，鲑鱼、鲱鱼和鲭鱼等鱼体中大量含有的多不饱和脂肪酸[如epa20:5(n-3)和dha 22:6(n-3)]对人体健康有益。除了能提高人体免疫力外，高不饱和脂肪酸还有益于预防心脑血管疾病、保护视力、促进婴儿的神经系统和视力发育。鱼肉中脂质含量较高也能增加鱼肉的嫩度、风味，使鱼肉的口感更好。除了脂质会影响鱼肉嫩度以外，鱼的肌纤维粗细也会影响嫩度。较细的肌纤维能使鱼肉口感更嫩。
2、然而，目前并未有能特定养殖肌纤维直径细、肌肉脂质积累的斑马鱼的方法。
技术实现思路
1、本专利技术提供的一种pnpla2基因缺失斑马鱼突变体的制备方法及其应用，旨在解决上述
技术介绍
中存在的问题。
2、为了实现上述技术目的，本专利技术主要采用如下技术方案：
3、第一方面，本专利技术公开了一种pnpla2基因缺失斑马鱼突变体的制备方法，包括如下步骤：
4、(1)构建针对pnpla2基因特异的crispr-cas9的靶序列，并设计靶位点grna；
5、(2)将敲除斑马鱼pnpla2基因的靶位点grna和cas9蛋白共同注射到斑马鱼胚胎中，获得pnpla2基因缺陷型突变体。
6、其中，本专利技术中的pnpla2基因又叫atgl基因，其实质上属于同一
7、在本专利技术的较佳实施方式中，步骤(1)中，所述针对pnpla2基因特异的crispr-cas9的靶序列具有如seq id no.1所示的核苷酸序列：gggtatttatcacatcggag。
8、在本专利技术的较佳实施方式中，步骤(1)中，设计靶位点grna，包括如下步骤：
9、(1)将针对pnpla2基因特异的crispr-cas9的靶序列接入sgrna质粒中；
10、(2)以sgrna质粒为模板，利用上游引物sgrna-f和下游引物sgrna-r进行pcr扩增，获得gdna，割胶回收，进行gdna纯化；所述上游引物sgrna-f具有如seq id no.2所示的核苷酸序列：taatacgactcactatagggtatttatcacatcggaggttttagagctagaaatagc；所述下游引物sgrna-r具有如seq id no.3所示的核苷酸序列：agcaccgactcggtgccact。
11、(3)对gdna进行转录，获得grna。
12、进一步的，pcr扩增体系如下：模板1μl、10×buffer 5μl、上游引物2μl、下游引物2μl、dntp 5μl、taq酶0.5μl、ddh2o 34.5μl，合计50μl；
13、pcr扩增程序如下：94℃5min、94℃30s、56℃30s、72℃15s、35个循环、、72℃5min、4℃1h。
14、进一步的，转录体系为：ntp 8μl，其中，每种各加2ul、5×buffer 4μl、gdna模板5.5μl、t7 enzyme 2μl、rnase inhibitor 0.5μl，合计20μl，以获得grna；
15、转录程序为：37℃水浴放置6h后，每管加入1.5μl dnase，混匀，37℃水浴15min。
16、在本专利技术的较佳实施方式中，步骤(2)中，注射体系为：grna 0.2μl、cas9蛋白0.5μl、cas9 buffer 0.3μl，合计1μl，grna终浓度为400ng/μl。
17、第二方面，本专利技术还公开了一种如第一方面所述的方法在培育肌纤维直径较细、肌肉脂质积累的斑马鱼中的应用。
18、在本专利技术的较佳实施方式中，所述应用包括如下步骤：
19、(1)获取pnpla2基因缺陷型突变体的斑马鱼的基因dna；
20、(2)以基因dna为模板，利用上游引物dna-f和下游引物dna-r进行pcr扩增，筛选具有突变的f0代斑马鱼；所述上游引物dna-f具有如seq id no.4所示的核苷酸序列：gcttatctctcctcggccac；所述下游引物dna-r具有如seq id no.5所示的核苷酸序列：cttgtcttcagtgccatcgt；
21、(3)将携带突变的f0代斑马鱼与野生型斑马鱼交配产生f1代，从f1代中筛选出pnpla2基因缺失的突变体，再让其雌雄交配，获得f2代斑马鱼，再从f2代斑马鱼中筛选出纯合子；
22、(4)将f2代纯合子斑马鱼雌雄交配，获得f3代斑马鱼，即获得肌纤维直径细、肌肉脂质积累的斑马鱼。
23、第三方面，本专利技术公开了一种检测pnpla2基因缺陷型突变体的斑马鱼的引物对，所述引物对包括上游引物dna-f和下游引物dna-r，所述上游引物dna-f具有如seq id no.4所示的核苷酸序列：gcttatctctcctcggccac；所述下游引物dna-r具有如seq id no.5所示的核苷酸序列：cttgtcttcagtgccatcgt。
24、与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
25、1、本专利技术首次在斑马鱼中利用crispr-cas9技术获得pnpla2基因缺失突变体，形成可以稳定遗传的突变体品系；
26、2、本专利技术通过crispr-cas9技术构建pnpla2基因缺失的斑马鱼突变体，与传统的基因编辑技术相比具有毒性小、准确性高、效率高、成本低、易操作、成功周期短等特点，而相对于传统遗传学操作方法，crispr-cas9系统能对预编辑的目标序列进行剪切，具有很强的正选压力，不需要额外使用选择标记，避免了传统操作方法中常遇到的可用选择标计已有限、引入抗生素标记产生生物安全隐患等；
27、3、本专利技术构建的斑马鱼pnpla2基因缺失突变体能用于培养获得肌纤维直径细、肌肉脂质积累的斑马鱼，为斑马鱼的遗传育种奠定基础；
28、4、与野生型斑马鱼相比，突变型斑马鱼的肌肉脂质和脂肪酸组成发生显著变化，其中，肌肉甘油三酯的比例显著增加，亚麻酸18:3ω-3、epa 20:5(n-3)、dha 22:6等多不饱和脂肪酸的比例均显著增加。
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1.一种pnpla2基因缺失斑马鱼突变体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的pnpla2基因缺失斑马鱼突变体的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述针对pnpla2基因特异的CRISPR-Cas9的靶序列具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列：GGGTATTTATCACATCGGAG。
3.根据权利要求1所述的pnpla2基因缺失斑马鱼突变体的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，设计靶位点gRNA，包括如下步骤：
4.根据权利要求3所述的pnpla2基因缺失斑马鱼突变体的制备方法，其特征在于，PCR扩增体系如下：模板1μl、10×Buffer 5μl、上游引物2μl、下游引物2μl、dNTP 5μl、Taq酶0.5μl、ddH2O 34.5μl，合计50μl；
5.根据权利要求3所述的pnpla2基因缺失斑马鱼突变体的制备方法，其特征在于，转录体系为：NTP 8μl，其中，每种各加2ul、5×Buffer 4μl、gDNA模板5.5μl、T7 Enzyme 2μl、RNase inhibitor
6.根据权利要求1所述的pnpla2基因缺失斑马鱼突变体的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，注射体系为：gRNA 0.2μl、Cas9蛋白0.5μl、Cas9 Buffer 0.3μl，合计1μl，gRNA终浓度为400ng/μl。
7.如权利要求1-6任一项所述的方法在培育肌纤维直径较细、肌肉脂质积累的斑马鱼中的应用。
8.根据权利7所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：
9.一种检测pnpla2基因缺陷型突变体的斑马鱼的引物对，其特征在于，所述引物对包括上游引物DNA-F和下游引物DNA-R，所述上游引物DNA-F具有如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列：GCTTATCTCTCCTCGGCCAC；所述下游引物DNA-R具有如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列：CTTGTCTTCAGTGCCATCGT。
...【技术特征摘要】
1.一种pnpla2基因缺失斑马鱼突变体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的pnpla2基因缺失斑马鱼突变体的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述针对pnpla2基因特异的crispr-cas9的靶序列具有如seq id no.1所示的核苷酸序列：gggtatttatcacatcggag。
3.根据权利要求1所述的pnpla2基因缺失斑马鱼突变体的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，设计靶位点grna，包括如下步骤：
4.根据权利要求3所述的pnpla2基因缺失斑马鱼突变体的制备方法，其特征在于，pcr扩增体系如下：模板1μl、10×buffer 5μl、上游引物2μl、下游引物2μl、dntp 5μl、taq酶0.5μl、ddh2o 34.5μl，合计50μl；
5.根据权利要求3所述的pnpla2基因缺失斑马鱼突变体的制备方法，其特征在于，转录体系为：ntp 8μl，其中，每种各加2ul、5×buffer 4μ...
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