Pyrvinium pamoate诱导的肌肉萎缩模型及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种Pyrvinium pamoate的新用途，并将Pyrvinium pamoate用于诱导肌肉发生萎缩，成功构建了肌肉萎缩细胞模型。本发明专利技术的肌肉萎缩细胞模型具有肌肉萎缩的典型特征，可极好地模拟体内肌肉萎缩的发生发展，是肌肉萎缩基础和临床应用研究的理想细胞模型，可良好地应用于筛选治疗肌肉萎缩的药物。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体涉及Pyrvinium pamoate诱导的肌肉萎缩模型及其应用。
技术介绍
目前的肌肉萎縮细胞模型主要通过血清饥饿制备，其模拟的是在营养不良情况下的肌肉萎缩，但是在现代社会由于营养不良造成的肌肉萎缩只占肌肉萎缩症患者中很小的比例，包括衰老相关肌肉萎缩在内的绝大多数肌肉萎缩都不是由营养不良造成的。要制备衰老相关肌肉萎缩的细胞模拟，目前只能从衰老小鼠肌肉中直接分离终末分化的肌纤维。这一方法耗时很长，需将小鼠至少饲养一年。一致性较差，由于小鼠存在个体差异，同样年龄的小鼠，其肌肉萎缩的程度存在比较大的差异。自体内直接分离的肌纤维只能在体外培养3－5天，再次使用必须另取新的小鼠进行分离。而由于小鼠间的个体差异，很难保证从不同个体中分离到的肌纤维的萎缩程度的一致性，因而妨碍采用此系统的实验的一致性。目前常用的肌肉萎缩动物模型主要通过限制进食获得，其模拟的是在营养不良情况下的肌肉萎缩。如上文所述，营养不良造成的肌肉萎缩在现代社会发生率很低，无法模拟衰老相关肌肉萎缩。另一获得衰老相关肌肉萎缩动物模型的方法是经长期饲养等动物衰老后作为模型使用。这一方法耗时很长，如上文所述，由于个体差异造成一致性很差，从而降低药物筛选实验的重复性。现有技术中，已知：小分子Pyrvinium pamoate，分子量1151.39，分子式C75H70N6O6，CAS号3546-41-6。但是未发现，小分子Pyrvinium pamoate与肌肉萎缩之间的关系。
技术实现思路
为了克服现有技术中的缺陷，本专利技术提供了一种Pyrvinium pamoate的新用途，并将Pyrvinium pamoate用于诱导肌肉发生萎缩，成功构建了肌肉萎缩细胞模型。本专利技术的肌肉萎缩细胞模型具有肌肉萎缩的典型特征，可极好地模拟体内肌肉萎缩的发生发展，是肌肉萎缩基础和临床应用研究的理想细胞模型，可良好地应用于筛选治疗肌肉萎缩的药物。本专利技术是通过以下技术方案实现的：本专利技术的第一方面，提供了Pyrvinium pamoate在制备诱导肌肉细胞发生萎缩的药物或 制剂中的用途。优选的，所述肌肉细胞为终末分化的肌肉细胞。优选的，所述药物或制剂还用于减小肌肉细胞中肌管的直径或横切面积。优选的，所述药物或制剂还用于上调肌肉细胞中Atroign-1和Murf-1等肌肉萎缩相关基因的表达水平。本专利技术的第二方面，提供了Pyrvinium pamoate在构建肌肉萎缩细胞模型或肌肉萎缩动物模型中的用途。本专利技术的第三方面，提供了一种构建肌肉萎缩细胞模型的方法，所述方法包括以下步骤：向肌肉细胞施用有效剂量的Pyrvinium pamoate；获得肌肉萎缩细胞模型。优选的，所述肌肉细胞为终末分化的肌肉细胞。优选的，所述终末分化的肌肉细胞选自以下任一：(1)由肌肉前体细胞、原代肌肉祖细胞或干细胞分化而成；(2)由体内肌肉分离得到终末分化的肌管细胞。在本专利技术的优选实例中，所述终末分化的肌肉细胞由肌肉前体细胞分化而成。所述肌肉前体细胞选自肌肉前体细胞系，如C2C12细胞。更优选的，所述终末分化的肌肉细胞是将肌肉前体细胞采用分化培养基培养2～4天，诱导分化而成。最优培养时间为3天。优选的，所述施用有效剂量的Pyrvinium pamoate的方法为：采用新鲜的含有效剂量的Pyrvinium pamoate的分化培养基，培养终末分化的肌肉细胞。在本专利技术的优选实例中，所述有效剂量的Pyrvinium pamoate是指Pyrvinium pamoate在分化培养基中的终浓度为2～15μM；培养时间为24～48小时。更优选的，Pyrvinium pamoate在分化培养基中的终浓度为5μM；培养时间为24小时。本专利技术的第四方面，提供了由前述方法构建的肌肉萎缩细胞模型在筛选药物中的用途。本专利技术的第五方面，提供了一种筛选治疗肌肉萎缩的候选药物的方法，所述方法包括以下步骤：将测试候选药物施用于由前述方法构建获得的肌肉萎缩细胞模型，并与未施用测试候选药物的肌肉萎缩细胞模型进行比较，其中施用后导致肌肉萎缩症状改善或治愈的测试化合物就是治疗肌肉萎缩的候选药物。上述筛选出的候选药物可构成一个筛选库，可对这些物质进行进一步的细胞实验、动物实验、和/或临床试验，以进一步确证所述潜在物质的治疗肌肉萎缩作用。由于本专利技术采用Pyrvinium pamoate进行诱导，所构建的模型更类似于人类的发病过程， 一致性高，因而在药物的筛选上比以往的模型更为精准，效率更高。本专利技术的有益效果在于：(1)本专利技术首次揭示了Pyrvinium pamoate能够诱导肌肉细胞发生萎缩，更类似于人类的发病过程，模型的一致性高。(2)本专利技术的肌肉萎缩细胞模型具有肌肉萎缩的典型特征，可极好地模拟体内肌肉萎缩的发生发展，是肌肉萎缩基础和临床应用研究的理想细胞模型，从而可良好地应用于筛选治疗肌肉萎缩的药物。附图说明图1：Pyrvinium pamoate诱导终末分化的肌肉细胞发生萎缩。与对照组相比，处理1天及两天后，实验组myotube直径明显变小。Scale bar：100μm。图2：直径统计显示，Pyrvinium pamoate处理后，myotube直径较对照组明显减小。图3：Pyrvinium pamoate造成肌肉萎缩。RT-qPCR结果显示，与对照组相比，实验组肌肉萎缩相关基因Atrogin-1和Murf-1表达量上调。图4:Pyvinium pamoate诱导的肌肉萎缩能够被Wnt3缓解，但是Wnt3无法缓解由血清饥饿造成的肌肉萎缩。具体实施方式本专利技术经过广泛而深入的研究，对多种小分子化合物及其使用方法进行测试，发现小分子Pyrvinium pamoate能够用于成功建立肌肉萎缩细胞模型。所述肌肉萎缩细胞模型具有肌肉萎缩的典型特征，可作为模型，良好地模拟肌肉萎缩的发生发展。同时，所述细胞模型还可应用于筛选治疗肌肉萎缩的候选药物。在此基础上完成了本专利技术。所述的肌肉萎缩是一种哺乳动物的疾病，其主要表现为以下的部分或全部特征：Myotube(肌管)直径或横切面积明显变小，肌肉萎缩特异标记基因Atroign-1和Murf-1的mRNA表达水平上调。具体而言，本专利技术人使用小分子Pyrvinium pamoate建立肌肉萎缩细胞模型，对细胞模型进行相关生物学测试，最终筛选到一种Myotube直径明显变小，Atroign-1和Murf-1的 mRNA表达水平上调的肌肉萎缩细胞模型。所述肌肉萎缩细胞模型表型稳定，并且在光镜、电镜下的形态特征与肌肉萎缩组织一致。光镜下显示，具有Myotube直径明显变小的特征。RT-qPCR分析显示，Atroign-1和Murf-1的mRNA高表达。Pyrvinium pamoate小分子Pyrvinium pamoate，分子量1151.39，分子式C75H70N6O6，CAS号3546-41-6。Pyrvinium pamoate的新用途本专利技术提供了Pyrvinium pamoate在制备诱导肌肉细胞发生萎缩的药物或制剂中的用途。所述肌肉细胞为终末分化的肌肉细胞。此外，所述药物或制剂还用于减小肌肉细胞中肌管的直径或横切面积。此外，所述药物或制剂还用于上调肌肉细胞中Atroign-1本文档来自技高网...

【技术保护点】
Pyrvinium pamoate在制备诱导肌肉细胞发生萎缩的药物或制剂中的用途。

【技术特征摘要】
1.Pyrvinium pamoate在制备诱导肌肉细胞发生萎缩的药物或制剂中的用途。2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物或制剂用于减小肌肉中肌管的直径或横切面积。3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物或制剂用于上调肌肉细胞中肌肉萎缩标志基因Atroign-1和Murf-1的表达水平。4.Pyrvinium pamoate在构建肌肉萎缩细胞模型或肌肉萎缩动物模型中的用途。5.一种构建肌肉萎缩细胞模型的方法，所述方法包括以下步骤：向肌肉细胞施用有效剂量的Pyrvinium pamoate；获得肌肉萎缩细胞模型。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述肌肉细胞为终末分化的肌肉细胞。7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述施用有效剂量的Py...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡苹，尹杰，徐博，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：上海;31