一种TSP4促进NG2细胞分化为神经细胞的实验方法技术

本发明专利技术公开了一种TSP4促进NG2细胞分化为神经细胞的实验方法，该方法包括以下步骤：细胞培养；质粒pXJ40‑myc‑TSP4的构建；Western印迹检测；免疫荧光；总RNA提取及实时荧光定量PCR；统计学处理。本发明专利技术旨在探究TSP4在NG2细胞向神经元细胞分化中的作用，并阐明TSP4调控NG2神经元分化的分子机制。TSP4可通过抑制MAPK/ERK信号通路的活性，促进NG2细胞向神经细胞转分化。本发明专利技术提供了一种实验手段，将TSP4在NG2细胞中过表达后，可有效诱发NG2细胞分化为神经细胞。本发明专利技术可为TSP4基因应用于脊髓损伤及神经退化性疾病的治疗提供重要依据。

An experimental method for promoting differentiation of NG2 cells into neurons by TSP4

The present invention discloses a kind of TSP4 promotes the differentiation of NG2 cells as the experimental methods of nerve cells, the method comprises the following steps: cell culture; plasmid pXJ40 myc TSP4; Western blotting; immunofluorescence; total RNA extraction and real-time fluorescence quantitative PCR; statistical analysis. The present invention aims to investigate the role of TSP4 in the differentiation of NG2 cells into neuronal cells, and to elucidate the molecular mechanism of TSP4 regulating the differentiation of NG2 neurons. TSP4 can promote the differentiation of NG2 cells into neural cells by inhibiting the activity of MAPK/ERK signaling pathway. The present invention provides an experimental means to effectively induce NG2 cells to differentiate into nerve cells after overexpression of TSP4 in NG2 cells. The invention can provide an important basis for the application of TSP4 gene in the treatment of spinal cord injury and neurodegenerative diseases.

【技术实现步骤摘要】
一种TSP4促进NG2细胞分化为神经细胞的实验方法
本专利技术属于生物
，涉及一种TSP4促进NG2细胞分化为神经细胞的实验方法。
技术介绍
随着世界各国经济水平的发展，脊髓损伤发生率呈现逐年增高的趋势。脊髓损伤是脊柱损伤最严重的并发症，往往会导致损伤节段以下肢体严重的功能障碍。神经细胞属于终末分化细胞，增殖能力较弱，一旦受到损伤，很难再生。脊髓损伤不仅会给患者本人带来身体和心理的严重创伤，还会对整个社会造成巨大的经济负担，因此，针对脊髓损伤的预防、治疗和康复已成为当今医学界的一大难题。在哺乳动物中枢神经系统中，存在一种胶质前体细胞，也因其表面表达硫酸软骨素蛋白多糖的特性，故称为NG2细胞。NG2细胞在发育以及成熟的中枢神经系统分布广泛，在特定的生理和病理条件下，可表现出形态的多样性、分化的可塑性以及功能的多样性等特点。我们前期的工作已证实，NG2细胞在一定的诱导条件下可转分化为神经元细胞，同时将诱导的NG2细胞移植到脊髓损伤小鼠体内后，发现病情有明显好转，这为脊髓损伤等神经损伤疾病的临床治疗带来了曙光。凝血栓蛋白4(thrombospondin4，TSP4)属于凝血栓蛋白家族，具有多种生物学功能，凝血栓蛋白家族成员是一类介导细胞-细胞、细胞-基质粘着的糖蛋白。Girard等证实TSP4缺陷的胎鼠以及成鼠大脑模型中，其神经元细胞的迁移能力显著削弱。它们与细胞的增殖、迁移、粘着以及连接有着密切的关系，对中枢神经系统损伤也会产生炎症反应。Kim等证明外周神经损伤后，TSP4可导致脊髓突触前过敏和神经病理性疼痛。这些结果提示，TSP4与神经细胞的发生和发展有着密切的关系。目前，TSP4如何调控少突胶质前体细胞(NG2细胞)向神经元细胞分化，促使神经元的再生，尚不清楚。已有研究报道，TSP4在脊髓敏感化、肌腱的形成以及神经病理性疼痛等疾病中扮演着重要的角色，但其在神经分化中的作用目前却鲜有报道。除我们2012年发现的另一基因NMEI外，目前尚无其它基因用于诱导NG2细胞分化为神经细胞的方法。本专利技术利用旨在建立一种方法，诱导少突胶质前体细胞-NG2细胞分化为神经细胞，为TSP4蛋白用于脊髓损伤的治疗提供帮助。
技术实现思路
为了克服现有技术中存在的缺陷，即难以在体外让NG2细胞分化为神经细胞，进而将其应用于脊髓损伤的治疗。本专利技术提供一种实验方法，将TSP4在NG2细胞中过表达后，可有效诱发NG2细胞分化为神经细胞。其技术方案如下：一种TSP4促进NG2细胞分化为神经细胞的实验方法，包括以下步骤：步骤1、细胞培养NG2细胞培养于含2％胎牛血清DMEM/F12培养基，100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素，B27supplement，N2supplement置于5％CO2的37℃恒温培养箱；步骤2、表达质粒pXJ40-myc-TSP4的构建根据GenBank中TSP4基因的mRNA序列NM_017133.1，并利用DNAMAN8.0软件设计引物，从大鼠cDNA文库中扩增TSP4基因，将扩增出来的片段连接到pXJ40-myc真核表达载体上，转化TOP10感受态细胞，氨苄霉素抗性LB琼脂板筛选单克隆菌落，摇菌并提取质粒，进行质粒酶切验证及电泳分析，将阳性质粒送苏州金唯智生物科技公司测序；步骤3、Western印迹检测加入细胞裂解液将细胞裂解，提取蛋白，采用Bradford方法进行蛋白质定量，加入5×SDS-PAGE上样缓冲液，100℃煮5分钟后上样，80V电泳30分钟，再120V电泳50分钟，390mA转膜70分钟，5％脱脂牛奶封闭1小时，一抗4℃过夜，用TBST漂洗3次，每次5分钟，加入相应的二抗孵育1小时，TBST漂洗3次，每次5分钟，AmershamImager600仪器进行化学发光，并用ImageJ1.48软件进行灰度分析；步骤4、免疫荧光将转染好的NG2细胞加入到铺有细胞玻片的12孔板中，待细胞爬片后进行相应处理：4％多聚甲醛固定细胞30分钟，PBS漂洗3次，每次5分钟。0.1％TritonX-100室温透化10分钟，PBS漂洗3次，每次5分钟。用3％BSA室温封闭1小时，PBS漂洗3次，每次5分钟。加入一抗MAP2、NF2004℃孵育过夜，PBS漂洗3次，每次5分钟，然后加入FITC标记的二抗，孵育2小时，DAPI复染5分钟，PBS漂洗3次，每次5分钟，90％甘油封片，激光共聚焦显微镜观察拍照；步骤5、总RNA提取及实时荧光定量PCRTrizol试剂抽提细胞总RNA，逆转录试剂盒合成cDNA，操作依照说明书进行，以cDNA为模板，进行实时荧光定量PCR，检测目的基因的表达，引物序列如下：GAPDH：5’-GGTCGGTGTGAACGGATTTG-3’；5’-GCTTCCCATTCTCAGCCTTGA-3’；NF200：5’-ACCTATACCCGAATGCCTTCT-3’；5’-AGAAGCACTTGGTTTTATTGCAC-3’；NeuN：5’-CAGGCCTCAGAAACACACAA-3’；5’-AGCACCAGTAGAAATGGATGA-3’；Tuj1：5’-TGACGAGCATGGCATAGACC-3’；5’-TGTTGCCAGCACCACTCTGA-3’；NeuroD1：5’-CTTGGCCAAGAACTATATCTGG-3’；5’-GGAGTAGGGATGCACCGGGAA-3’。反应体系为：EvaGreen2×qPCRMasterMix10μL，上游引物0.6μL，下游引物0.6μL，模板cDNA2μL，双蒸水6.8μL，反应程序：95℃10分钟，95℃15秒，60℃1分钟，共40个循环。基因的相对表达量用2-ΔΔCt法计算，大鼠GAPDH作为内参基因；步骤6、统计学处理采用SPSS18.0统计软件进行统计学处理。以均数±标准差表示，各组间观察指标的比较采用单因素方差分析和最小显著差法，检验水准α值取双侧P＜0.05。进一步，步骤3免疫印迹结果显示，过表达TSP4基因的实验组与对照组相比，TSP4能够促进NG2细胞神经元分化标志蛋白NF200、Tuj1和MAP2的表达；过表达TSP4基因的实验组与对照组相比，TSP4能够促进NG2细胞ERK信号通路的活化，而对p38和AKT信号通路无显著影响；当用U0126阻断ERK信号通路后，NG2细胞的神经元标志蛋白NeuN的表达增加。进一步，步骤4免疫荧光染色结果显示，过表达TSP4基因的实验组与对照组相比，TSP4能够促进NG2细胞神经元分化标志蛋白NF200和MAP2的表达。进一步，步骤5荧光定量PCR结果显示，过表达TSP4基因的实验组与对照组相比，TSP4能够促进NG2细胞神经元分化标志基因NeuN、NF200、Tuj1和NeuroD1的表达；当用U0126阻断ERK信号通路后，NG2细胞的神经元标志基因NeuN、NF200、Tuj1和NeuroD1的表达显著增加。本专利技术中的实验结果显示，TSP4可通过抑制MAPK/ERK信号通路的活性，进而促进NG2细胞向神经细胞转分化。Western印迹和real-timePCR结果显示，过表达TSP4实验组中，神经元分化标志蛋白NeuN、NF200及Tuj-1表达均上调，同时伴随ERK的磷本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种TSP4促进NG2细胞分化为神经细胞的实验方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、细胞培养NG2细胞培养于含2％胎牛血清DMEM/F12培养基，100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素，B27supplement，N2supplement置于5％CO

【技术特征摘要】
1.一种TSP4促进NG2细胞分化为神经细胞的实验方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、细胞培养NG2细胞培养于含2％胎牛血清DMEM/F12培养基，100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素，B27supplement，N2supplement置于5％CO2的37℃恒温培养箱；步骤2、表达质粒pXJ40-myc-TSP4的构建根据GenBank中TSP4基因的mRNA序列NM_017133.1，并利用DNAMAN8.0软件设计引物，从大鼠cDNA文库中扩增TSP4基因，将扩增出来的片段连接到pXJ40-myc真核表达载体上，转化感受态TOP10，氨苄霉素抗性LB琼脂板筛选单克隆菌落，摇菌并提取质粒，进行质粒酶切验证及电泳分析，将阳性质粒送苏州金唯智生物科技公司测序；步骤3、Western印迹检测加入RIPA裂解液将细胞裂解，提取总蛋白，采用Bradford方法对蛋白质进行定量，加入5×SDS-PAGE上样缓冲液，100℃煮5分钟后上样，80V电泳30分钟，再120V电泳50分钟，390mA转膜70分钟，5％脱脂牛奶封闭1小时，一抗4℃过夜，用TBST漂洗3次，每次5分钟，加入相应的二抗孵育1小时，TBST漂洗3次，每次5分钟，AmershamImager600仪器进行化学发光，并用ImageJ1.48软件进行灰度分析；步骤4、免疫荧光将转染好的NG2细胞加入到铺有细胞玻片的12孔板中，待细胞爬片后进行相应处理：4％多聚甲醛固定细胞30分钟，PBS漂洗3次，每次5分钟；0.1％TritonX-100室温透化10分钟，PBS漂洗3次，每次5分钟；用3％BSA室温封闭1小时，PBS漂洗3次，每次5分钟；加入MAP2、NF200一抗4℃孵育过夜，PBS漂洗3次，每次5分钟，然后加入FITC标记的二抗，孵育2小时，DAPI复染5分钟，PBS漂洗3次，每次5分钟，90％甘油封片，激光共聚焦显微镜进行观察拍照；步骤5、总RNA提取及实时荧光定量PCRTrizol试剂抽提细胞总RNA，逆转录试剂盒合成cDNA，操作参照说明书进行，以cDNA为模板，进行实时荧光定量PCR，检测目的基因的表达，引物序列如下：GAPDH：5’-GGTCGGTGTGAACGGATTTG-3’；5’-GCTTCCCATTCTCAGCCTTGA-3’；NF200：5’-ACCTATACCCGAATGCCTTCT-3’；5’-AGAAGCACTTGGTTTTATTGCAC-3’；NeuN：5’-CAGGCCTCAGAAAC...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨海杰，马双平，王勉，王磊，程彬峰，
申请(专利权)人：新乡医学院，
类型：发明
国别省市：河南,41