一种含毛囊组织工程皮肤的制备方法技术

一种含毛囊组织工程皮肤的制备方法，本发明专利技术是将组织工程毛囊均匀接种于由支架材料与细胞复合形成的组织工程真皮层中，再覆以表皮细胞，经培养后即形成含毛囊的组织工程皮肤；本发明专利技术克服了以往混合注射所造成的皮肤中毛囊数量小、不均匀、毛囊量不可控的缺点，所制备的组织工程皮肤含有表皮、真皮以及毛囊样组织结构，其中毛囊数量接近天然数量并均匀分布于人工毛孔中，毛囊在体外培养中和经移植后继续发育，形成多层的同心圆结构，内层为微囊膜所包裹的毛乳头细胞，外层为上皮类细胞；经体外培养或体内移植的皮肤最终形成含毛囊附属结构的功能性皮肤，可实现皮肤移植后的毛囊再生。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物材料的组织工程
，具体涉及一种含有毛囊的组织工程皮肤的制备方法。
技术介绍
组织工程是生命科学领域的研究热点，相关的研究涉及到各个方面。其内容是将 体外培养的功能细胞种植于相应的支架材料，经培养后形成具有一定功能的组织或器官。 随着组织工程技术的迅速发展，组织工程皮肤已开始在临床上广泛使用。目前的组织工程 皮肤主要是将皮肤真皮细胞和表皮细胞种植于皮肤支架材料，由此构建的组织工程皮肤具 有与正常皮肤相似的真皮和表皮二层结构，但没有毛囊、皮脂腺等皮肤的附属器官，在组织 结构上与正常皮肤组织仍存在有差异。 皮肤是人体最大的器官，具有保护机体、调节体温、排泄废物等功能。但由于炎症、 溃疡、外伤、烧伤、肿瘤术后以及先天畸形等原因造成皮肤和粘膜的缺损或异常，使皮肤功 能受损或丧失，从而导致内脏器官失去保护，甚至影响生命。采用自体皮瓣和自体皮肤移植 会造成供皮区的新创伤，常由于供皮区来源有限无法满足大面积移植的需要。组织工程皮 肤的应用缓解了这种危机，但不含附属器官的组织工程皮肤，在功能上不能满足患者需求。 毛囊是皮肤重要的附属器官，在皮肤的生理过程中有重要的作用。头部毛囊的缺 失和异常会导致斑秃或全秃，影响美观的同时也影响了患者的生活质量；而身体部位的毛 囊异常则严重影响了身体的代谢和热量交换，致使患者只能在恒温的环境中生活。因此，毛 囊的再生成为解决上述问题的关键。 在发育生物学研究中，毛囊是上皮与间充质相互作用的典型器官，在胚胎发育早 期，表皮细胞向下突起形成毛钉，毛钉向下延伸、膨大形成皮脂腺的胚基，膨大处为立毛肌 的胚基，进一步形成毛锥，皮脂腺、立毛肌逐渐成形，最后形成毛乳头、内毛根鞘，毛囊内有 毛干形成。成熟的毛囊分为毛干、上皮根鞘、真皮鞘及毛乳头四部分。上皮根鞘紧贴毛干，由 多层角化上皮细胞组成，由内向外可分为内根鞘和外根鞘，内根鞘在皮脂腺开口水平与内 陷的表皮相连，类似于表皮的透明层和角化层，外根鞘的细胞类似于表皮基底层和棘层的 细胞；真皮鞘及其周围的致密结缔组织是由真皮转化而来，相当于皮肤的真皮层；毛乳头 细胞也是真皮源性的细胞，对于毛囊的发育生物学具有重要的作用，在体内外都可以诱导 毛囊生成。有证据表明，毛囊在减少皮肤瘢痕形成、提高皮肤创伤愈合速度和伤口愈合质量 上有重要的作用；并在毛囊隆突部位的毛囊外根鞘细胞中，存在有支持毛囊上皮细胞更新 的毛囊干细胞，不仅在毛囊周期性生长中起重要作用，同时也是表皮自我更新的细胞来源； 另外，真皮鞘细胞和毛乳头细胞在一定条件下可以互相转化，起到维持毛囊生长的作用，并 显示出一些干细胞的特性，在皮肤创伤后可以转化为皮肤成纤维细胞参与或直接参与皮肤 真皮组织的重建，促进皮肤愈合。 微胶囊技术是将分散的各种物质(包括固体、液体、气体及生物物质)包封在一层 由高分子材料组成的膜中，形成直径为50 1000 ii m的球状微胶囊的技术。将蛋白酶和激素等生物活性物质包封在选择性透过膜中形成的球状微胶囊，称为生物微胶囊。研究报道， 将微胶囊技术与组织细胞移植相结合，把细胞包封在膜内，其特点是选择性透过膜可避免 免疫系统对囊内细胞的攻击，而小分子的营养物质和囊内生物活性物质及代谢产物可自由 出入。 目前，含毛囊组织工程皮肤的研究已成为热点。模拟胚胎早期毛囊形成的条件，将 上皮类细胞与间充质类细胞混合，经体内培养可实现毛囊的再生；多是采用将具有诱导毛 囊再生作用的毛乳头细胞与毛囊外根鞘细胞或毛囊干细胞混合后注入皮肤支架中培养，以 期形成含毛囊组织工程皮肤；其中毛囊的形成，无论从数量还是所形成的毛囊结构，都不理 想。早期毛囊是上皮细胞凹陷并聚集包绕成团的间充质细胞后经发育逐渐形成，而混合注 入的上皮类细胞与间充质细胞接触无序，使得细胞间需相互识别后自我组织重排，由此形 成的毛囊结构及大小不均。皮肤中的毛囊应是分布均匀且数量巨大，局部形成或仅有少量 形成的毛囊是无法起到相应的生理作用。 针对已有技术所存在的问题，本专利技术的目的是提供一种含毛囊组织工程皮肤的制备方法，使所制备的组织工程皮肤含有大量的毛囊结构，可实现皮肤移植后的毛囊再生。 本专利技术所提出的含毛囊组织工程皮肤的制备方法，其特征在于，是将组织工程毛囊均匀接种于由支架材料与细胞复合形成的组织工程真皮层中，再覆以表皮细胞，经培养后即形成含毛囊的组织工程皮肤；所述的组织工程毛囊是将间充质来源的毛乳头细胞或可向毛乳头细胞分化的干细胞包裹于高分子材料中形成粒径为200 1000iim的微囊，再采用旋转培养方法将上皮来源的毛囊外根鞘细胞或是具有干细胞功能的上皮类细胞包裹于微囊外围形成粒径为250 1100 ii m的组织工程毛囊；所述的支架材料与所述的高分子材料一样，为机体可接受的生物可降解材料，可以选择细胞外基质、胶原、透明质酸、硫酸软骨素、明胶、纤维蛋白胶、壳聚糖、海藻酸盐、蛋白多糖、聚赖氨酸、聚乳酸、聚羟基乙酸的任一种或是几种的组合。 所述的各类细胞为自体或是异体来源细胞；其中，微囊内的毛乳头细胞或是可向 毛乳头细胞分化的干细胞，可以选择胚胎干细胞、IPS细胞、骨髓间充质干细胞、造血干细 胞、或毛囊真皮鞘干细胞的任一种；微囊外层的毛囊外根鞘细胞或是具有干细胞功能的上 皮类细胞，可以选择表皮干细胞、毛囊干细胞、或毛囊隆突部干细胞的任一种。 本专利技术制备方法的具体步骤包括 步骤一、配制培养液 培养液A :在含有V/V为15%胎牛血清的商用DMEM培养液500ml中，加有表皮生 长因子EGF 2 10 ii g、成纤维细胞生长因子bFGF 5 50ng、牛垂体提取物BPE 3 15g ; 培养液B :在无血清商用Williams E培养液500ml中，加有EGF 2 10iig、bFGF 5 50ng、BPE 3 15g、胰岛素样生长因子IGF-15 50ng ; 培养液C :在含有V/V为10%胎牛血清的商用DMEM培养液500ml中，加有胰岛素 2 50ng、氢化可的松10 500 ii g、腺嘌呤10 17mg、Vc 5 30mg、EGF 2 10 ii g、bFGF 5 50ng、 BPE 3 15g j 培养液D :在培养液C中含有0. 1 lmM浓度的氯化钙；
技术实现思路
培养液E :在培养液C中含有0. 2 2mM浓度的氯化钙； 培养液F :在培养液C中含有0. 3 3mM浓度的氯化钙； 步骤二、获取细胞 毛乳头细胞的获取与培养可参照文献程波等改良毛乳头细胞培养法《中华皮肤 科杂志》2001 34(5)387 388或是其他已有技术，获得生长状态良好且具有凝集性生长 特征的毛乳头细胞；不同来源的干细胞经毛乳头细胞培养上清液的诱导培养，具有毛乳头 细胞特征后，可作为组织工程毛囊的微囊内细胞。毛囊外根鞘细胞的获取与培养可参照文 献唐建兵等人毛囊外根鞘细胞的培养《中华烧伤杂志》2003 19(1)47 48或是其他 已有技术，获得生长状态良好的毛囊外根鞘细胞；其他上皮来源的干细胞可参考已有技术 获取，无需诱导即作为组织工程毛囊的外层细胞。成纤维细胞和表皮细胞的获取与培养可 参照《组织工程学原理与技术》金岩主编第四军医大学出版社239 240或是其他已 有技术获得。 步骤三、制备组织工程本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种含毛囊组织工程皮肤的制备方法，其特征在于，是将组织工程毛囊均匀接种于由支架材料与细胞复合形成的组织工程真皮层中，再覆以表皮细胞，经培养后即形成含毛囊的组织工程皮肤；所述的组织工程毛囊是将间充质来源的毛乳头细胞或可向毛乳头细胞分化的干细胞包裹于高分子材料中形成粒径为２００～１０００μｍ的微囊，再采用旋转培养方法将毛囊外根鞘细胞或是具有干细胞功能的上皮类细胞包裹于微囊外围，形成粒径为２５０～１１００μｍ的组织工程毛囊；所述的支架材料与所述的高分子材料一样，为机体可接受的生物可降解材料。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：金岩，凡孝菊，张勇杰，王爱军，
申请(专利权)人：中国人民解放军第四军医大学，陕西瑞盛生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：87[中国|西安]