一种诱导多能干细胞分泌素的制备方法及其应用技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种诱导多能干细胞分泌素的制备方法及其应用。本发明专利技术提供的诱导多能干细胞分泌素的制备方法，包括诱导多能干细胞处理、诱导多能干细胞增殖、诱导多能干细胞分泌素获取和纯化、浓缩，即通过培养诱导多能干细胞，取上清液，过滤，浓缩得到诱导多能干细胞分泌素。本发明专利技术制备方法简单易行，适宜大规模生产，有效提高了诱导多能干细胞分泌素的产量，且本发明专利技术制备的诱导多能干细胞分泌素可有效应用于保健品及化妆品中。

Method for preparing induced pluripotent stem cell secretory hormone and application thereof

The invention belongs to the technical field of biology, in particular to a preparation method of an induced pluripotent stem cell secretory hormone and an application thereof. The present invention provides the induced pluripotent stem cells secrete preparation method of pigment, including induced pluripotent stem cells, induced pluripotent stem cell proliferation, induced pluripotent stem cells secretion obtained and purified and concentrated, namely through the cultivation of induced pluripotent stem cells, the supernatant was filtered, concentrated by secretin induced pluripotent stem cells. The preparation method of the invention is simple, suitable for mass production, effectively improve the secretion of induced pluripotent stem cell production, and the preparation method of the secretin induced pluripotent stem cells can be effectively applied to health care products and cosmetics.

【技术实现步骤摘要】
一种诱导多能干细胞分泌素的制备方法及其应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种诱导多能干细胞分泌素的制备方法及其应用。
技术介绍
诱导多能干细胞(inducedpluripotentstemcells,iPScells)最初是日本人山中申弥(ShinyaYamanaka)于2006年利用病毒载体将四个转录因(Oct4,Sox2,Klf4和c-Myc)的组合转入分化的体细胞中，使其重编程而得到的类似胚胎干细胞的一种细胞类型。iPS细胞不仅可用于分化和移植，还可以提供体外的疾病模型，以便于研究疾病形成的机制、筛选新药以及开发新的治疗方法。人类iPS细胞的建立被公认为2007年最重要的科技进展之一，这项技术不仅可以从体细胞建立个体特异的多能干细胞系，解决了细胞移植治疗中的免疫排斥问题，而且为研究人类细胞的重编程的机理以及研究个体特异的疾病发生机理提供了有力的方法。在体外，iPS细胞可定向诱导分化出多种细胞，比如神经干细胞、肝脏干细胞、心肌干细胞等，因此，iPS细胞在理论研究和临床应用等方面都极具应用价值。在诱导多能干细胞增殖分化过程中会分泌出多种生长因子、蛋白质、活性多肽、微量元素等促进细胞生长、活化、再生等的物质。虽然诱导多能干细胞分泌素的市场潜力很大，但其大量培养存在着较大困难，目前报道尚未多见。中国专利CN102732586B公开了一种间充质干细胞分泌素的制备方法，所述制备方法包括细胞培养，分泌素溶液收集培养，纯化，浓缩，利用了生物反应器技术替代传统的细胞培养瓶去制作间充质干细胞分泌素，大幅缩减成本及所需空间，提高了充质干细胞细胞分泌素的产量。中国专利申请CN101461772A公开了用于美容护肤的干细胞分泌因子的制备方法，所述制备方法包括细胞分离、干细胞扩增、干细胞因子体系的获取和浓缩、贮存，该专利技术简单易行，适宜大规模生产。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种诱导多能干细胞分泌素的制备方法及其应用。本专利技术提供的诱导多能干细胞分泌素的制备方法简单易行，适宜大规模生产，有效提高了诱导多能干细胞分泌素的产量。本专利技术提供了一种诱导多能干细胞分泌素的制备方法，包括以下步骤：S1重悬诱导多能干细胞，得诱导多能干细胞悬液；S2将步骤S1所得诱导多能干细胞悬液分布于三维载体，并置于一生物反应器的诱导多能干细胞培养液中，在37℃、5％CO2条件下培养24-72h，得诱导多能干细胞；S3在步骤S2中诱导多能干细胞分裂旺盛阶段，用磷酸缓冲液冲洗诱导多能干细胞和三维载体2-4次，然后向生物反应器中加入基础培养液IMDM/F12与磷酸缓冲液继续培养6-24h，收集生物反应器中的上清液，得分泌素溶液；S4将步骤S3所得分泌素溶液离心，超膜过滤，浓缩，即得。本专利技术诱导多能干细胞分泌素通过超膜过滤，截留分子量为30KD，浓缩后所得的多种生命活性物，其包括蛋白质、多肽及生物活性因子等多种成分。诱导多能干细胞分泌素中的多种生命活性成分具有复杂的生理作用，每种成分都可以对许多组织器官产生影响，同时每种形式生理机能的提高也不是单一因子的作用，而是需要多种因子的相互协调作用。该分泌物具有促进细胞增殖、分化、凋零，防止细胞衰老，参与免疫调节，抗氧化等作用。进一步地，所述步骤S2中细胞培养基包括基础培养基IMDM/F12和添加剂；其中，添加剂为2-4mg/mL人白蛋白、40-60μg/mL维生素C和3-7mg/mL人参皂苷单体Rb1。人参皂苷单体Rb1可以显著提高诱导多能干细胞诱导效率，并可以显著延缓细胞的衰老和促进细胞的增殖。进一步地，所述步骤S2中细胞培养基由基础培养基IMDM/F12和添加剂组成；其中，添加剂为3mg/mL人白蛋白、50μg/mL维生素C和5mg/mL人参皂苷单体Rb1。进一步地，所述步骤S2中诱导多能干细胞密度为1×108-1×109个/L。进一步地，所述步骤S3中基础培养液IMDM/F12与磷酸缓冲液的体积比为1:(2-6)。进一步地，所述步骤S3中磷酸缓冲液的浓度为0.01M，pH值为7.3。进一步地，所述步骤S4中浓缩方式为通过切向流过中控纤维超滤柱，体积浓缩1/8。同时，本专利技术制得的诱导多能干细胞分泌素可用于保健品或化妆品中。与现有技术相比，本专利技术提供的诱导多能干细胞分泌素的制备方法简单易行，适宜大规模生产，有效提高了诱导多能干细胞分泌素的产量，且在抗衰老、抑制黑色素及修复受损细胞的应用中效果较好。具体实施方式下面通过具体实施例对本专利技术做进一步说明，这些实施例仅用于例证的目的，并不限制于本专利技术的保护范围。实施例1一种诱导多能干细胞分泌素的制备方法所述制备方法包括以下步骤：S1重悬诱导多能干细胞，得诱导多能干细胞悬液；S2将步骤S1所得诱导多能干细胞悬液分布于三维载体，并置于一生物反应器的诱导多能干细胞培养液IMDM/F12+2mg/mL人白蛋白+40μg/mL维生素C+3mg/mL人参皂苷单体Rb1中，在37℃、5％CO2条件下培养24h，得诱导多能干细胞；S3在步骤S2中诱导多能干细胞分裂旺盛阶段，用0.01M的磷酸缓冲液(pH＝7.3)冲洗诱导多能干细胞和三维载体2次，然后向生物反应器中加入基础培养液IMDM/F12与磷酸缓冲液(体积比为1:2)继续培养6h，收集生物反应器中的上清液，得分泌素溶液；S4将步骤S3所得分泌素溶液离心，超膜过滤，通过切向流过中控纤维超滤柱浓缩1/8，即得。实施例2一种诱导多能干细胞分泌素的制备方法所述制备方法包括以下步骤：S1重悬诱导多能干细胞，得诱导多能干细胞悬液；S2将步骤S1所得诱导多能干细胞悬液分布于三维载体，并置于一生物反应器的诱导多能干细胞培养液IMDM/F12+3mg/mL人白蛋白+50μg/mL维生素C+5mg/mL人参皂苷单体Rb1中，在37℃、5％CO2条件下培养48h，得诱导多能干细胞；S3在步骤S2中诱导多能干细胞分裂旺盛阶段，用0.01M的磷酸缓冲液(pH＝7.3)冲洗诱导多能干细胞和三维载体3次，然后向生物反应器中加入基础培养液IMDM/F12与磷酸缓冲液(体积比为1:4)继续培养15h，收集生物反应器中的上清液，得分泌素溶液；S4将步骤S3所得分泌素溶液离心，超膜过滤，通过切向流过中控纤维超滤柱浓缩1/8，即得。实施例3一种诱导多能干细胞分泌素的制备方法所述制备方法包括以下步骤：S1重悬诱导多能干细胞，得诱导多能干细胞悬液；S2将步骤S1所得诱导多能干细胞悬液分布于三维载体，并置于一生物反应器的诱导多能干细胞培养液IMDM/F12+4mg/mL人白蛋白+60μg/mL维生素C+7mg/mL人参皂苷单体Rb1中，在37℃、5％CO2条件下培养72h，得诱导多能干细胞；S3在步骤S2中诱导多能干细胞分裂旺盛阶段，用0.01M的磷酸缓冲液(pH＝7.3)冲洗诱导多能干细胞和三维载体3次，然后向生物反应器中加入基础培养液IMDM/F12与磷酸缓冲液(体积比为1:6)继续培养24h，收集生物反应器中的上清液，得分泌素溶液；S4将步骤S3所得分泌素溶液离心，超膜过滤，通过切向流过中控纤维超滤柱浓缩1/8，即得。对比例1一种诱导多能干细胞分泌素的制备方法所述制备方法包括以下步骤：S1重悬诱导多能干细胞，得诱导多能干细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种诱导多能干细胞分泌素的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1重悬诱导多能干细胞，得诱导多能干细胞悬液；S2将步骤S1所得诱导多能干细胞悬液分布于三维载体，并置于一生物反应器的诱导多能干细胞培养液基中，在37℃、5％CO2条件下培养24‑72h，得诱导多能干细胞；S3在步骤S2中诱导多能干细胞分裂旺盛阶段，用磷酸缓冲液冲洗诱导多能干细胞和三维载体2‑4次，然后向生物反应器中加入基础培养液IMDM/F12与磷酸缓冲液继续培养6‑24h，收集生物反应器中的上清液，得分泌素溶液；S4将步骤S3所得分泌素溶液离心，超膜过滤，浓缩，即得。

【技术特征摘要】
1.一种诱导多能干细胞分泌素的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1重悬诱导多能干细胞，得诱导多能干细胞悬液；S2将步骤S1所得诱导多能干细胞悬液分布于三维载体，并置于一生物反应器的诱导多能干细胞培养液基中，在37℃、5％CO2条件下培养24-72h，得诱导多能干细胞；S3在步骤S2中诱导多能干细胞分裂旺盛阶段，用磷酸缓冲液冲洗诱导多能干细胞和三维载体2-4次，然后向生物反应器中加入基础培养液IMDM/F12与磷酸缓冲液继续培养6-24h，收集生物反应器中的上清液，得分泌素溶液；S4将步骤S3所得分泌素溶液离心，超膜过滤，浓缩，即得。2.如权利要求1所述的诱导多能干细胞分泌素的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中细胞培养基包括基础培养基IMDM/F12和添加剂；其中，添加剂为2-4mg/mL人白蛋白、40-60μg/mL维生素C和3-7mg/mL人参皂苷单体Rb1。3.如权利要求2所述的诱导多能干细胞分泌素...

【专利技术属性】
技术研发人员：车七石，
申请(专利权)人：广州润虹医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44