一种松口蘑人工菌塘的诱导方法技术

本发明专利技术涉及一种松口蘑人工菌塘的诱导方法，其特征在于：ａ）容器先用洗涤剂洗净、冲洗并晾干；ｂ）在经７０％酒精表面消毒的工作台上，用７０％酒精和０．０５－１．０％次氯酸钠溶液先后对容器以及容器盖进行喷雾消毒，并保留消毒液５－２０分钟，用量为５－２０ｍｌ消毒液／１００ｍｌ容器；ｃ）将容器口朝下，放置于经表面消毒的工作台上，自然干燥３０－４０分钟；ｄ）容器干燥后，将含水量为２０％（ｖ／ｖ）、添加了事先用无水乙醇（１．４％，ｖ无水乙醇／ｖ干土）混溶过橄榄油－油浓度为０．５－２．０％（油ｖ／干土ｖ）并经高压灭菌的培养土直接装入容器中，再接入松口蘑菌块或菌液，加盖或封口，在２０－３０℃黑暗条件下进行诱导培养。本发明专利技术成功地进行了松口蘑人工菌塘的诱导，它具有方法简便，适合非实验室操作；成本低廉，适合在松口蘑产区进行实际推广应用，以增加该食用菌的产量。

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种松口蘑人工菌塘的诱导方法，尤其是一种适合非实验室操作的实验方法。
技术介绍
松口蘑[Tricholoma matsutake(S.Ito.et.Imai)Sing.]—世界上最名贵的菌根型食用菌之一，是国家二级保护植物。在我国主要分布于东北地区的吉林、黑龙江，西南地区的云南、四川，其它如山西、安徽、台湾、西藏等省区也有零星分布。国外主要分布于日本、朝鲜、俄罗斯等国。松口蘑是一种富含蛋白质、多种维生素和大量糖类的美味食品，世界上以日本人最喜欢食用松口蘑，近年来由于环境的恶化和需求量的扩大，日本本土产量已远远不能满足其国内市场的需要，因此每年都大量从外国进口。松口蘑出口已成为其产地的一个重要产业，经济效益相当可观。关于松口蘑的人工栽培研究已经进行了一个世纪之久，但是迄今为止，除了形成几个子实体原基(Ogawa&Hamada，1975)外，尚没有栽培成功的例子见诸报端。近年来，关于无菌条件下松口蘑人工菌根苗诱导成功的报导有很多(Yamada et al.，1999a；Guerin-Laguette et al.，2000a；Vaario et al.，2000)，这种人工菌根苗可以进行野外栽培，然而，尽管大多数菌根真菌在侵染宿主植物根部后都能够进行扩展生长(Read，1991；Guerin-Laguette et al.，2000b；Wu et al.，2001)，可松口蘑菌丝体即便是其在宿主植物根内形成哈蒂氏网后仍很难进一步生长，移栽后的菌根苗会出现菌丝退化现象，并且菌根也仅能存活4个月左右(Yamada et al.，2001)。这种有限生长的外延菌丝根本无法形成天然条件下松口蘑子实体形成的关键场所—菌塘，因而也就无法继续进行子实体的诱导实验。菌塘是由密生的白色或灰白色菌丝体与植物根系及土壤颗粒相互交错纽结而成的团状结构(Ogawa，1975a；Hosford et al.，1997；Yamada et al.，1999b)，松口蘑整个生活史及其子实体的产生都是在菌塘上完成的(弓明钦等，2002)。Ogawa(1975a)在观察野外松口蘑菌塘的扩展生长时发现，为了维持菌落的进一步生长发育，与宿主植物相连的菌丝体需要有一个临界生物量。由此可见，人工菌根苗形成后菌丝体在基质中能否顺利生长扩展形成可以满足子实体发生的菌塘，对于松口蘑人工栽培的成功与否是十分关键的问题。日本东京大学的研究人员对于快速诱导松口蘑人工菌根及工人菌塘的形成作了很深入的研究(Ogawa et al.，1974，1975b；Guerin-Laguette et al.，2001)，他们已报道在无菌土壤或人工基质条件下，将松口蘑菌液接种于发芽1个月的赤松苗木上3～4个星期后，赤松的侧根上就能形成很典型的哈蒂氏网，诱导出人工菌根。他们这一快速人工菌根诱导技术还获得了日本国专利(铃木和夫等，1999)。同时，他们还发现，界面活性剂及植物油对于松口蘑菌丝体的生长具有促进作用(Vaario et al.，2002；Guerin-Laguette et al.，2003)，这一发现对于松口蘑人工菌塘的诱导有着很大的意义。然而，这些诱导方法都存在着一定的缺陷—如Yamada(1999b)和Guerin(2003)等都是对诱导用容器使用了高压灭菌法进行消毒，由于大容量的塑料容器或比较廉价的塑料器皿大都不耐高温，用γ-射线消毒是一种解决问题的办法(寺村智，2000)，但费用高，一般实验室或实验站不可能有这样的设施。所以这些诱导法虽然在理论上可行，但实际操作上却存在很大难度。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服了上述技术中存在的不足之处，提出一种在以橄榄油为主要添加物的土壤中诱导菌丝体生长且适合非实验室操作的松口蘑人工菌塘的诱导方法。为了达到上述目的，本专利技术采用的技术方案是a)容器先用洗涤剂洗净、冲洗并晾干；b)在经70％酒精表面消毒的工作台上，用70％酒精和0.05-1.0％次氯酸钠溶液先后对容器内壁以及容器盖进行喷雾消毒，并保留消毒液5-20分钟，用量为5-20ml消毒液/100ml容器；c)将容器口朝下，放置于经表面消毒的工作台上，自然干燥30-40分钟；d)容器干燥后，将含水量为20％(v/v)、添加了事先用无水乙醇(1.4％，v无水乙醇/v干土)混溶过橄榄油—油浓度为0.5-2.0％(油v/干土v)并经高压灭菌的培养土直接装入容器中，再接入松口蘑菌块或菌液，加盖或封口，在20-30℃黑暗条件下进行诱导培养。所述的培养土包含自然土与人工基质混合物。所述的人工基质包含蛭石和珍珠岩。根据权利要求1所述的一种松口蘑菌塘的诱导方法，其特征在于，所述的培养土含有0.5％-2.0％橄榄油，优选为1％。所述的培养土是在高压灭菌锅中温度为121度、时间持续40-60分钟的条件下进行消毒。本专利技术的优点是1)成功的进行了松口蘑人工菌塘的诱导2)方法简便，适合非实验室操作3)成本低廉，适合在松口蘑产区进行实际推广应用，以增加该食用菌的产量4)添加物为自然食用物质，适合应用于松口蘑人工子实体诱导的研究具体实施方式下面对本专利技术的实施例做进一步详细描述a)容器先用洗涤剂洗净、冲洗并晾干；b)在经70％酒精表面消毒的工作台上，用70％酒精和0.05-1.0％次氯酸钠溶液先后对容器以及容器盖进行喷雾消毒，并保留消毒液5-20分钟，用量为5-20ml消毒液/100ml容器；c)将容器口朝下，放置于经表面消毒的工作台上，自然干燥30-40分钟；d)容器干燥后，将含水量为20％(v/v)、添加了事先用无水乙醇(1.4％，无水乙醇v/v干土)混溶过橄榄油—油浓度为0.5-2.0％(油v/干土v)并经高压灭菌的培养土直接装入容器中，再接入松口蘑菌块或菌液，加盖或封口，在20-30℃黑暗条件下进行诱导培养。所述的培养土包含自然土与人工基质混合物。所述的人工基质包含蛭石和珍珠岩。所述的培养土是在高压灭菌锅中温度为121度、时间持续40-60分钟的条件下进行消毒。1)容器消毒将试管(Φ3.5mm×L17mm)先用洗涤剂洗净、冲洗并晾干。在经70％酒精表面消毒的超净工作台上，首先用70％酒精喷洒内壁并放置5分钟后，晾30分钟，然后再分别用0.05-1.0％次氯酸钠溶液喷洒内壁并放置5分钟，同样晾30分钟。两次操作中消毒液用量为5ml/100ml容器。2)检测消毒液浓度对种子发芽的影响将上述方法消毒的试管作为培养容器，在每个试管中倒入经高压灭菌的含葡萄糖5g/l的琼脂(1.0g/l)培养基30ml，每个浓度四个重复。首先观察五周试管内的污染情况，然后在试管中接入种子进行发芽实验，每个管中接入消毒后的赤松种子2粒，分别观察其污染率以及种子的发芽旅。从表1中可以看出，次氯酸钠溶液浓度为零时，一周后四个管中有三个产生了污染，两周后所有试管全部污染；而当溶液浓度为0.05-1.0％时，所有试管到第五周末都没有产生污染，且到第八周结束时，发芽率分别为1.0％--50％；0.5％-62.5％；0.1％-72.5％；0.05％-87.5％。表1次氯酸钠溶液消毒试管观察记录表 “----”四个试管都无污染；“-+++”三个有污染，一个没有；“++++”四个都有污染当次氯本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种松口蘑菌塘的诱导方法，其特征在于：ａ）容器先用洗涤剂洗净、冲洗并晾干；ｂ）在经７０％酒精表面消毒的工作台上，用７０％酒精和０．０５－１．０％次氯酸钠溶液先后对容器内壁以及容器盖进行喷雾消毒，并保留消毒液５－２０分钟，用量 为５－２０ｍｌ消毒液／１００ｍｌ容器；ｃ）将容器口朝下，放置于经表面消毒的工作台上，自然干燥３０－４０分钟；ｄ）容器干燥后，将含水量为２０％（ｖ／ｖ）、添加了事先用无水乙醇（１．４％，ｖ无水乙醇／ｖ干土）混溶过橄榄油－油浓度 为０．５－２．０％（油ｖ／干土ｖ）并经高压灭菌的培养土直接装入容器中，再接入松口蘑菌块或菌液，加盖或封口，在２０－３０℃黑暗条件下进行诱导培养。

【技术特征摘要】
1一种松口蘑菌塘的诱导方法，其特征在于a)容器先用洗涤剂洗净、冲洗并晾干；b)在经70％酒精表面消毒的工作台上，用70％酒精和0.05-1.0％次氯酸钠溶液先后对容器内壁以及容器盖进行喷雾消毒，并保留消毒液5-20分钟，用量为5-20ml消毒液/100ml容器；c)将容器口朝下，放置于经表面消毒的工作台上，自然干燥30-40分钟；d)容器干燥后，将含水量为20％(v/v)、添加了事先用无水乙醇(1.4％，v无水乙醇/v干土)混溶过橄榄油—油浓度为0.5-2.0％(油v/干土v)并经高压灭菌的培养土直接装入容器中，再...

【专利技术属性】
技术研发人员：李玉花，伦志明，邢树堂，孙雪，傅禄敏，
申请(专利权)人：东北林业大学，李玉花，
类型：发明
国别省市：93[中国|哈尔滨]