用β‑(1,4)‑N‑乙酰半乳糖胺转移酶或其突变体修饰糖蛋白的方法技术

本发明专利技术涉及一种用β‑(1,4)‑N‑乙酰半乳糖胺转移酶或其突变体修饰糖蛋白的方法。所述方法包括以下步骤：在β‑(1,4)‑N‑乙酰半乳糖胺转移酶或其突变体的存在下，使包含含有末端GlcNAc部分的聚糖的糖蛋白与非天然的糖衍生物核苷酸接触。所述非天然的糖衍生物核苷酸如式(3)所示：

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用β-(1,4)-N-乙酰半乳糖胺转移酶或其突变体修饰糖蛋白的方法
本专利技术涉及酶法修饰糖蛋白的方法。更具体地，本专利技术涉及使用β-(1,4)-N-乙酰半乳糖胺转移酶或其突变体用糖衍生物核苷酸修饰糖蛋白的方法，以及涉及β-(1,4)-N-乙酰半乳糖胺转移酶突变体。
技术介绍
糖基转移酶构成参与糖蛋白和糖脂上存在的复合碳水化合物的合成的酶的超家族。糖基转移酶的基本作用是将核苷酸衍生物的糖基部分转移至特定的糖受体。β-1,4-半乳糖基转移酶(β4Gal-T)(EC2.4.1.38)组成糖基转移酶超家族的亚家族之一，所述亚家族至少包含Gal-T1至Gal-T7七个成员，其催化半乳糖(Gal)从UDP-Gal转移至不同的糖受体。半乳糖转移酶在末端GlcNAc残基上产生的共有基序是乳糖胺序列Galβ4GlcNAc-R(LacNAc或LN)，其随后通过添加其他糖和硫酸根基团以多种方式修饰。膜糖缀合物的最常见和最重要的糖结构是聚-N-乙酰乳糖胺(聚-LN)，其连接至蛋白(或脂质)，在细胞通讯、黏附和信号传导中起重要作用，并且是免疫应答调节中的重要分子。在脊椎动物和无脊椎动物糖缀合物中存在的另一个共有的末端基序是GalNAcβ4GlcNAc-R(LaCdiNAc或LDN)序列。LDN基序存在于哺乳动物垂体糖蛋白激素中，其中末端GalNAc残基是4-O-硫酸化的，并且作为内皮细胞Man/S4GGnM受体清除的识别标志物。然而，非垂体哺乳动物糖蛋白还含有LDN决定簇。此外，LDN和LDN序列的修饰是许多寄生线虫和吸虫中的常见抗原决定簇。LDN的生物合成涉及将GalNAc转移至末端GlcNAc，这是由高度特异性GalNAc转移酶执行的过程。例如由Miller等人在J.Biol.Chem.2008,283,第1985页(通过引用的方式纳入本文)中报道，认为两个密切相关的β1,4-N-乙酰半乳糖胺转移酶——β4GalNAc-T3和β4GalNAc-T4——引起β1,4连接的GalNAc至许多糖蛋白(包括糖蛋白促黄体激素(LH)和碳酸酐酶-6(CA6))上的Asn-连接的寡糖的蛋白特异性的添加。已经在一系列生物体中鉴定了β-(1,4)-乙酰半乳糖胺转移酶(β-(1,4)-GalNAcT)，所述生物体包括人、秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)(Kawar等人,J.Biol.Chem.2002,277,34924，通过引用纳入本文)、黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)(Hoskins等人，Science2007,316,1625，通过引用的方式纳入本文)和粉纹夜蛾(Trichoplusiani)(Vadaie等人,J.Biol.Chem.2004,279,33501，通过引用的方式纳入本文)。最后，除了参与N-糖蛋白修饰的GalT和GalNAcT之外，称为UDP-N-乙酰半乳糖胺：多肽N-乙酰半乳糖胺转移酶(也称为ppGalNAcT)的非相关类别的酶负责粘蛋白型连接(GalNAc--1-O-SeR/ThR)的生物合成。这些酶将GalNAc从糖供体UDP-GalNAc转移至丝氨酸和苏氨酸残基，形成O-糖蛋白中典型的α端基异构键。尽管ppGalNAcT催化功能看似简单，但是基于计算机分析估计仅有24种独特的ppGalNAcT人类基因。因为O-连接的糖基化逐步进行，将GalNAc添加到至丝氨酸或苏氨酸中代表粘蛋白生物合成中的第一个关键步骤。尽管这看似简单，但多个ppGalNAcT家族成员对于其蛋白底物的完全糖基化似乎是所必需的。已经表明，β-1,4-半乳糖基转移酶1(β4Gal-T1)除了转移其天然底物UDP-Gal之外，还能够将一系列非天然半乳糖衍生物转移至受体GlcNAc底物。特别地，如由Ramakrishnan等人J.Biol.Chem.2002,23,20833(通过引用的方式纳入本文)所报道的，牛β4Gal-T1中TyR289残基至Leu289的突变在酶的催化口袋中产生了空腔，其可以容纳在C2处携带化学柄的UDP-Gal分子，例如2-酮基-Gal。通过包括首先转移非天然半乳糖部分，接着将肟连接到C-2柄上的两步过程，该突变型酶β4GalT(Y289L)已经用于体外检测蛋白上的O-GlcNAc残基或正常和恶性肿瘤组织的细胞表面聚糖上的末端GlcNAc部分的存在。例如Khidekel等人,J.Am.Chem.Soc.2003,125,16162(通过引用的方式纳入本文)公开了非天然酮官能团到具有β4GalT(Y289L)的O-GlcNAc修饰的蛋白的化学选择性安装。酮部分充当独特标记物以使用肟连接用生物素来“标记”O-GlcNAc糖基化蛋白。一旦被生物素化，可以使用与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的链霉亲和素通过化学发光来容易地检测糖缀合物。例如WO2007/095506、WO2008/029281(均为InvitrogenCorporation的)、WO2014/065661(SynAffixB.V.)和Clark等人J.Am.Chem.Soc.2008,130,11576(均通过引用的方式纳入本文)报道了类似的方法，其使用β4GalT(Y289L)和半乳糖胺的叠氮乙酰基变体，取得了类似的成功。最近，突变体β4GalT(Y289L)也以制备方式应用于对抗体的重链聚糖进行位点选择性放射性标记，如Zeglis等人在Bioconj.Chem.2013,24,1057(通过引用的方式纳入本文)中所报道的。特别地，将叠氮化物修饰的N-乙酰半乳糖胺单糖(GalNAz)整合至抗体的聚糖允许在合适的螯合剂的点击化学引入之后用89Zr进行受控标记。Ramakrishnan等人在Biochemistry2004,43,12513(通过引用的方式纳入本文)中描述了双突变体β4GalT(Y289L、M344H)失去其Mn2+依赖性活性的98％，但是在Mg2+存在下表现出25-30％的活性，包括转移C-2修饰的半乳糖底物的能力。发现双突变体β4GalT(Y289L、M344H)可用于体外半乳糖苷化测定，因为已知5-10mMMn2+的典型需求对细胞具有潜在的细胞毒性作用。Mercer等人,Bioconj.Chem.2013,24,144(通过引用的方式纳入本文)描述了在Mg2+的存在下，双突变体Y289L-M344H-β4Gal-T1酶将GalNAc和类似物糖转移至受体GlcNAc。使用野生型β-(1,4)-N-乙酰半乳糖胺转移酶(在本文也称为β-(1,4)-GalNAcT)用于转移C-2修饰的GalNAc的尝试迄今已获得了小小的成功。Bertozzi等人在ACSChem.Biol.2009,4,1068(通过引用的方式纳入本文)中应用生物正交化学报道技术用于粘蛋白型O-聚糖在活的秀丽隐杆线虫中的分子成像。将蠕虫用N-乙酰半乳糖胺(GalNAz)的叠氮基-糖变体处理，使得能够体内纳入这种非天然糖。虽然观察到GalNAz代谢性整合到糖蛋白中，但是对秀丽隐杆线虫溶解产物的软骨素酶ABC和肽N-糖苷酶F(PNGaseF)消化，随后使用膦-Flag标签进行的施陶丁格连接以及随后通过使用α-Flag抗体的Wes本文档来自技高网...

【技术保护点】
修饰糖蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：在β‑(1,4)‑N‑乙酰半乳糖胺转移酶或其突变体的存在下，使包含含有末端GlcNAc部分的聚糖的糖蛋白与糖衍生物核苷酸Su(A)‑Nuc接触，其中：(i)所述含有末端GlcNAc部分的聚糖如式(1)或(2)所示：

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.08.04 EP 14179713.41.修饰糖蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：在β-(1,4)-N-乙酰半乳糖胺转移酶或其突变体的存在下，使包含含有末端GlcNAc部分的聚糖的糖蛋白与糖衍生物核苷酸Su(A)-Nuc接触，其中：(i)所述含有末端GlcNAc部分的聚糖如式(1)或(2)所示：其中：b为0或1；d为0或1；e为0或1；以及G为单糖，或包含2至20个糖部分的直链或支链寡糖；以及(ii)所述糖衍生物核苷酸Su(A)-Nuc如式(3)所示：其中：a为0或1；Nuc为核苷酸；U为[C(R1)2]n或[C(R1)2]p-O-[C(R1)2C(R1)2O]o-[C(R1)2]q，其中n为0至24的整数；o为0至12的整数；q和p独立地为0、1或2；R1独立地选自H、F、Cl、Br、I和任选取代的C1-C24烷基；T为C3-C12(杂)亚芳基，其中(杂)亚芳基被任选地取代；以及A选自：(a)-N3(b)-C(O)R3其中R3为任选取代的C1-C24烷基；(c)-C≡C-R4其中R4为氢或任选取代的C1-C24烷基；(d)-SH(e)-SC(O)R8其中R8为任选取代的C1-C24烷基；(f)-SC(V)OR8其中V为O或S，R8为任选取代的C1-C24烷基；(g)-X其中X选自F、Cl、Br和I；(h)-OS(O)2R5其中R5选自C1-C24烷基、C6-C24芳基、C7-C24烷基芳基和C7-C24芳基烷基，所述烷基、芳基、烷基芳基和芳基烷基被任选地取代；(i)R11其中R11为任选取代的C2-C24烷基；(j)R12其中R12为任选取代的末端C2-C24烯基；和(k)R13其中R13为任选取代的末端C3-C24丙二烯基。2.权利要求1的方法，其中当U为[C(R1)2]n时，n为1至24的整数，当U为[C(R1)2]p-O-[C(R1)2C(R1)2O]o-[C(R1)2]q时，o为1至12的整数和/或p为1或2和/或q为1或2。3.权利要求1的方法，其中U不存在。4.前述权利要求中任一项的方法，其中所述糖衍生物核苷酸Su(A)-Nuc如式(9)或(10)所示：其中Nuc、A、U和T如权利要求1中所定义。5.前述权利要求中任一项的方法，其中如果存在T，T选自亚苯基、亚吡啶基、亚吡啶鎓基、亚嘧啶基、亚嘧啶鎓基、亚吡嗪基、亚吡二嗪基、亚吡咯基、亚吡咯鎓基、亚呋喃基、亚噻吩基、亚二唑基、亚喹啉基、亚咪唑基、亚噁唑基和亚噁唑鎓基，其中所述(杂)亚芳基被任选地取代。6.前述权利要求中任一项的方法，其中所述糖衍生物核苷酸如式(11)、(12)、(13)、(14)、(15)、(16)、(34)或(35)所示：其中：A如权利要求1中所定义；以及m为0至4的整数；R2独立地选自-F、-Cl、-Br、-CN、-NO2...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·A·瓦西尔，F·L·范代尔夫特，S·S·范博凯尔，
申请(专利权)人：西纳福克斯股份有限公司，
类型：发明
国别省市：荷兰,NL