本发明专利技术涉及生产和纯化唾液酸转移酶，特别是N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)-α-2，6-唾液酸转移酶I(ST6GalNAcI)多肽的方法。方法包括在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中生产唾液酸转移酶多肽的步骤和用色谱步骤的组合纯化多肽的步骤。方法导致高产量的唾液酸转移酶多肽，所述唾液酸转移酶多肽是高纯度和活性的。获得的唾液酸转移酶，特别是ST6GalNAcI可用于治疗蛋白质例如G-CSF的糖基化。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及生产和纯化唾液酸转移酶多肽，特别是N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)-a-2，6唾液酸转移酶I(ST6GalNAcI)多肽的方法。方法包括在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中生产唾液酸转移酶多肽和用色谱步骤的组合来纯化多肽的步骤。方法导致高产量的高纯度和酶促活性的唾液酸转移酶多肽。获得的唾液酸转移酶，特别是ST6GalNAcI可用于治疗蛋白例如G-CSF的糖基化。
技术介绍
自然界存在多种寡糖结构和许多类型的糖肽，它们部分地由大量糖基转移酶合成。糖基转移酶通过将活化的单或寡糖残基从供体转移到已有的受体分子以起始或延伸糖链，来催化糖脂、糖肽和多糖的合成。认为催化反应涉及糖基转移酶的适当的结构域以及酶的催化位点对供体和受体的识别。超过30%的全部治疗蛋白和许多可能的肽治疗剂是糖基化的肽。本领域熟知，正确的多糖结构的附着可在治疗肽的折叠、生物活性、生物分布和药物学效力中起关键作用。此外，糖基化是影响治疗肽的体内半寿期和免疫原性的关键性重要因素。实际上，人通常只耐受具有特别类型的糖附着物的生物治疗剂，并通常排斥包括非哺乳动物寡糖附着物的糖蛋白。例如，未充分糖基化的肽被肝识别为“旧的”，因而比适当糖基化的肽被更快地从身体清除。相反，过度糖基化的肽或错误糖基化的肽能够是免疫原性的。重组糖肽的生产，与重组非糖基化肽相反，要求对重组生产的肽进行额外的加工步骤，所述步骤在细胞内体内进行或在肽由细胞生产后体外进行。可酶促处理肽，使用糖基转移酶通过将一个或多个糖基基团共价附着到肽上，向肽引入一个或多个糖基基团。由外部的肽加工的体外步骤生产糖肽是费时而昂贵的。这部分地因为生产用于肽和糖肽的体外糖基化以生产糖肽治疗剂的重组糖基转移酶的负担和花费。由于重组糖治疗剂的需求和使用增加，需要新的方法以更高效地制备糖肽。此外，由于越来越多的糖肽被发现用于多种疾病的治疗，存在对降低其生产成本的方法的需求。此外，本领域也存在对开发更高效地生产重组糖肽的方法的需求，所述重组糖肽用于发展和改善糖肽治疗剂。在WO 2003/031464 A2中公开了糖基转移酶及其在蛋白质的糖基化中的用途。唾液酸转移酶构成催化唾液酸(N-乙酰神经氨酸)翻译后转移至位于糖蛋白和糖脂末端位置的受体寡糖底物的糖基转移酶家族(Paulson等人，1989，J.Biol.Chem.264:17615-17618)。据估计人基因组编码超过20种不同的、合成哺乳动物细胞中存在的所有已知唾液-寡糖结构所需的唾液酸转移酶，但仅克隆了 16种不同的人唾液酸转移酶cDNA(Tsuji S 等人，1996，Glycobiology6:5_7 ；Tsuji S，1996，J.Biochem.120:1_13 ；Weinstein J等人，1982，J.Biol.Chem.257 =13835-13844)。最初，唾液酸转移酶是用生物化学方法纯化的，其cDNA是用N端序列克隆的。获得的cDNA序列的比较显示了 2个高度保守的区域，称为L-和S-唾液酰基序，它们参与底物结合。随后，通过使用在唾液酰基序内设计的简并引物的PCR或通过表达克隆,克隆了若干唾液酸转移酶(Nara K等人，1994, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA91:7952-7956 ；Nakayama J 等人，1996，J.Biol.Chem.271:3684-3691 ；Nakayama J 等人，1995，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 92:7031-7035)。通过差异展示进行的基因克隆增加了鉴定在疾病相关过程中具有推定的功能意义的新型唾液酸转移酶的完全不同的方法。唾液酸转移酶在其底物特异性和组织分布中存在差异，并且根据其合成的糖键分为四个家族:ST3Gal-、ST6Gal-、ST6GalNAc-和ST8Sia_家族。每个家族的成员显示对某些受体基团的强活性，尽管这些酶的底物特异性重叠；一种键可由多个酶合成。在治疗糖肽的开发和生产中有效用的一种此类特别的唾液酸转移酶是N-乙酰半乳糖胺-α 2，6-唾液酸转移酶(ST6GalNAcI)，它催化唾液酸从唾液酸供体转移到唾液酸受体。全长鸡 ST6GalNAcl 酶，例如，由 Kurosawa 等人公开(1994，J.Biol.Chem.，269:1402-1409)。过去，已为增加用于体外生产糖肽的重组唾液酸转移酶的有效性进行了努力。Institute of Physical&Chemical Research 的 EP 0 737 745 Al 和 US5, 032，519涉及大肠杆菌用于生产分泌形式的蛋白质的用途，所述蛋白质包含源自ST6GaINAcI并且负责其活性的部分，即活性结构域。Neose Technologies Inc.的 WO 2007/056524 A2 描述了生产经修饰的ST6GalNAcI多肽的方法，此方法包括在适于在原核宿主细胞中表达修饰的ST6GalNAcI多肽的条件下培养重组原核宿主细胞。这些经修饰的ST6GalNAcI是嵌合多肽，其包含来自Gal-β l，3GalNAc-a2，3_唾液酸转移酶(ST3GalI)多肽的第一部分和来自GalNAc-α-2，6-唾液酸转移酶I (ST6GaINAcI)多肽的第二部分。经修饰的ST6GalNAcI多肽还能够是真核或原核宿主细胞中缺少全部或部分ST6GalNAcI信号结构域、全部或部分ST6GalNAcI跨膜结构域和/或全部或部分ST6GalNAcI茎结构域的截短的多肽。Neose Technologies In`c.的US 2006/0234345 Al 公开了在具有氧化环境的原核微生物中生产可溶性真核糖基转移酶的方法，所述方法通过a)在原核微生物中表达编码真核糖基转移酶的核酸；然后b)在允许在原核微生物的细胞区室内表达可溶性活性真核糖基转移酶的条件下培养原核微生物。Skretas 等人(2009, Microbial Cell Factories,8:50)涉及在经改造的大肠杆菌菌株中表达人唾液酸转移酶ST6GalNAcI的方法，所述经改造的大肠杆菌菌株拥有特定类型的氧化细胞质或共表达分子伴侣/辅分子伴侣触发因子，DnaK/DnaJ、GroEL/GroES和Skp,并能生产极大增加的量的可溶性ST6GaINAcI。然而，尽管开发了若干用于克服这些限制的工具，大肠杆菌对于蛋白质折叠和形成二硫键的能力不足。此外，重组蛋白质在大肠杆菌表达系统中的高表达产量通常可导致聚集的、不可溶性蛋白质的积累，形成包涵体，这是获得可溶性活性蛋白质的重要阻碍(Brondyk W.H.,2009, Methods in Enzymology, Vol.463, Ch.11)。为克服与大肠杆菌培养物中重组唾液酸转移酶的生产相关的问题，开发了昆虫细胞培养物系统。US2006/0246544A1和US2008/0207487A1公开了制造包括重组多肽(例如唾液酸转移酶)的组合物的方法，其中多肽在昆虫细胞中表达(例如使用杆状病毒表达系统)，并且其中组合物基本没有内切葡聚糖酶活性。方法包括对包括多肽的混合物进行包括以下步骤的混合模式色谱:(i)将混合物与混合模式色谱介质接触；和本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.08.02 EP 10171626.41.生产唾液酸转移酶多肽的方法，所述方法包括以下步骤: a)在CHO细胞中表达唾液酸转移酶多肽；收集含有经表达的唾液酸转移酶多肽的细胞培养基；和 b)通过对细胞培养基进行(i)至少一次亲和色谱和/或混合模式色谱步骤和(ii)至少一次阴离子交换色谱和/或阳离子交换色谱步骤，从细胞培养基纯化唾液酸转移酶多肽。2.根据权利要求1的方法，其中唾液酸转移酶是ST6GalNAcI。3.根据权利要求2的方法，其中ST6GalNAcI选自以下所组成的组:人、黑猩猩、猩猩、猪、牛、狗、大鼠、小鼠和鸡ST6GalNAcI。4.根据权利要求3的方法，其中ST6GalNAcI是鸡ST6GalNAcI。5.根据权利要求4的方法，其中ST6GalNAcI多肽包含根据SEQID NO:4或SEQ ID NO:6的氨基酸序列。6.根据权利要求1至5中任一项的方法，其中唾液酸转移酶多肽只包含唾液酸转移酶活性结构域。7.根据权利要求1至6中任一项的方法，其中编码EPO信号序列和唾液酸转移酶多肽序列的表达盒被用于在CHO细胞中表达唾液酸转移酶多肽。8.根据权利要求1至7中任一项的方法，其中通过在达到预定的细胞密度后应用从370C +/_1°C至32°C +/ -1°C的孵育温度改变来实施步骤a)。9.根据权利要求1至8中任一项的方法，其中步骤b)包括:(i)两次亲和色谱步骤或一次亲和色谱步骤和一次混合模式色谱步骤，( ) 一次阴离子交换色谱步骤和(iii) 一次阳离子交换色谱步骤。10.根据权利要求1至9中任一项的方法，其中按以下顺序实施步骤b): 1.阴离子交换色谱； .第一次亲和色谱； ii1.第二次亲和色谱或混合模式色谱； iv.阳离子交换色谱；11.根据权利要求1至10中任一项的方法，其中使用携带季铵作为功能基团的树脂进行阴离子交换色谱。12.根据权利要求11的方法，其中使用pH处于7.0和8.0之间的范围的NaCl/Tris-...
【专利技术属性】
技术研发人员：A·安格曼，C·谢克曼，K·施密特，
申请(专利权)人：拜奥吉耐里克斯有限公司，
类型：
国别省市：
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