用于产生脱唾液酸化免疫球蛋白的方法和载体技术

本发明专利技术涉及用于产生脱唾液酸化免疫球蛋白的方法和载体。通过由用编码唾液酸酶的载体序列转染表达含Fc蛋白质的细胞系改变Fc区中寡糖的唾液酸化，来控制含Fc蛋白质例如抗体的性质。修饰的含Fc蛋白质在疾病或状况中具有治疗功用，在所述疾病或状况中希望控制对于FcγRI、FcγRIIA和FcγRIIIA受体的一种或多种的亲和力、ADCC活性、巨噬细胞或单核细胞活化、血清半衰期和抗体亲抗原性。

【技术实现步骤摘要】
【专利说明】用于产生脱唾液酸化免疫球蛋白的方法和载体 本申请是申请日为2007年12月26日，申请号为200780051802. 3 (国际申请号为 PCT/US2007/088809)，专利技术名称为"用于产生脱唾液酸化免疫球蛋白的方法和载体"的专利技术 专利申请的分案申请。 专利技术背景 专利
本专利技术涉及产生与Fc受体相互作用的治疗蛋白质例如抗体的方法，其中寡糖链 的组成就抗体与其靶的抗体亲抗原性以及Fc受体结合亲和力进行最优化，从而与产生糖 基化抗体的非最优化方法相比较，最优化所述抗体的效应子功能活性。 相关技术的描述 抗体是在先天免疫中发挥显著作用的可溶性血清糖蛋白。在重链恒定区中的保 守位置处所有天然产生的抗体的碳水化合物结构都随同种型而变化。每种同种型都具有N 联寡糖结构的不同阵列，这反复不定地地影响蛋白质装配、分泌或功能活性（Wright，A.和 Morrison，S. L.，Trends Biotech. 15 :26-32 (1997))。参考图 1 和 2,依赖于加工程度，附着 的N联寡糖结构相当不同，并且可以包括高甘露糖，以及含或不含二等分GlcNAc和核心岩 藻糖残基的复杂双触角寡糖（Wright，A.和Morrison，S. L.，同上）。一般地，存在在特定糖 基化位点处附着的核心寡糖结构的异质加工，从而使得甚至单克隆抗体也作为多重糖形存 在。类似地，已显示抗体糖基化中的主要差异在抗体产生细胞系之间发生，并且甚至对于在 不同培养条件下生长的给定细胞系可见微小差异。 在聚糖上的唾液酸（静止基团）已知在延长除抗体外的糖蛋白的血清半衰期中是 重要的（Stockert，R.J. (1995) Physiol. Rev. 75, 591-609)。迄今为止，唾液酸对单克隆抗 体（Mabs)的作用仍未完全了解。Mabs的血清半衰期特别长寿，并且Fc-融合蛋白的构建已 证明是在开发治疗蛋白质例如蛋白质enteracept中有用的策略。 抗体和T细胞受体分子具有负责特异性细胞表面受体结合的区域，所述结合调节 细胞应答。在免疫系统中，这些功能分类为体液和细胞的。抗体通常称为连接体液和细胞 免疫机制的衔接分子：体液应答主要归因于能够与靶抗原高亲和力结合的成熟的、分泌的、 循环抗体。细胞应答归因于通过ab-ag复合物的结合和通过下游结局的细胞激活结果，所 述下游结局通过由于ab-ag复合物与效应细胞结合释放的细胞介质引起。这些细胞应答包 括靶的中和、调理作用和致敏作用（如果抗原展示于细胞表面上）、肥大细胞的致敏作用和 补体激活。对于细胞靶，即，细胞表面抗原，这些效应子功能导致通常所谓的抗体依赖性细 胞毒作用（ADCC)和依赖补体的细胞毒性（CDC)。 在抗体同种型（例如，IgE、IgD、IgA、IgM和IgG)中，IgGs是最丰富的，其中IgGl 亚类显示出最显著程度和大量的效应子功能。IgGl类型的抗体是癌症免疫治疗中最常用 的抗体，在所述癌症免疫治疗中ADCC和CDC活性通常视为重要的。在结构上，IgG铰链区 和CH2结构域在抗体效应子功能中起重要作用。Fc区（由铰链、CH2和CH3结构域的二聚 化形成）中存在的N联寡糖影响效应子功能。共价结合的寡糖是复杂双触角类型结构，并 且是高度异质的（参见图1和2)。在Asn297处的保守N联糖基化位点位于每个CH2结 构域中。在成熟抗体中，与Asn297附着的2个复杂双触角寡糖包埋在CH2结构域之间，与 多肽主链形成广泛接触。已发现它们的存在对于抗体介导效应子功能例如ADCC是必需 的（Lifely，M. R.，等人，Glycobiology 5 :813_822 (1995) ; Jefferis，R.，等人，Immunol Rev. 163 :59-76 (1998) ;Wright，A?和 Morrison，S. L.，同上）〇由各种宿主细胞产生的装饰Fc部分抗体或抗体衍生结构包含的异质寡糖占优势 地包含唾液酸、岩藻糖、半乳糖和GlcNAc残基作为末端糖（Raju，T. S.，等人Glycobiology 2000. 10(5) :477-86)。已显示这些末端糖中的一些，特别是暴露的半乳糖、核心岩藻糖和 二等分GlcNAc残基，影响分子的Fc部分的结构且由此改变抗体效应子功能。效应子功能 例如ADCC活性和CDC活性可以通过附加聚糖的组成加以改变，所述效应子功能依赖于与称 为Fc受体的细胞表面受体的结合，以及与各种配体包括Clq补体蛋白质的结合（Presta L. 2003.Curr Opin Struct Biol.l3(4) :519-25)。在Fc处附着的大多数N联聚糖未唾液酸 化至显著程度（Idusogie EE，等人 2000. J Immunol. 15:164(8) :4178_84)。 在人IgG和其他重组产生的IgGs中发现的大多数结构是含或不含暴露的Gal残 基的复杂双触角结构（图1)。存在许多哺乳动物宿主细胞，其目前用于表达重组抗体用于 研究目的以及生物制药生产。宿主细胞起源物种以及培养条件可以引起与重组表达分子附 加的聚糖程度和结构改变。用于抗体的重组表达的2种常用宿主细胞系是中国仓鼠卵巢细 胞（CH0)和小鼠骨髓瘤细胞（sp2/0、653、NS0)。尽管CH0细胞表达几乎缺乏唾液酸聚糖的 重组抗体，但聚糖是99%岩藻糖基化的。岩藻糖的存在已显示是减少的Fc-y III受体和因 此ADCC的主要贡献者。小鼠骨髓瘤细胞表达具有最高达50%唾液酸但具有一般较少的岩 藻糖的重组抗体。如上所述，这些差异可以对体内抗体活性具有显著影响。 因此，希望能够以这样的方式减少与治疗抗体相关的聚糖唾液酸化，所述方式消 除关于收获后加工的需要，且同时提供就唾液酸含量而言合理地同质结构。 专利技术概述 本专利技术包含用于生产具有减少的唾液酸含量的含Fc分子特别是抗体治疗剂的方 法、宿主细胞系、以及表达载体和质粒。更具体而言，本专利技术包含编码工程改造的唾液酸酶 编码序列的表达质粒，所述质粒一旦整合入抗体分泌宿主细胞系内，就使得宿主细胞能够 分泌具有唾液酸酶活性的多肽。在一个实施方案中，在质粒内的编码序列编码产脲节杆菌 (Arthrobacter ureafaciens)唾液酸酶的催化结构域。在本专利技术的进一步方面，包含产脲 节杆菌唾液酸酶的催化结构域的宿主细胞将翻译的催化结构域分泌到培养基内。 本专利技术包含用于控制含Fc分子的性质的方法，其包括使与Fc区附着的寡糖的唾 液酸化降到最低，由此最优化分子对于多种定位的靶蛋白质的抗体亲抗原性和对于一种或 多种Fey受体例如？〇丫1?1、？〇丫1?114和？〇丫1?1114受体的亲和力他(1：活性；巨噬细胞或 单核细胞活化；和血清半衰期。 本专利技术还涉及在Fc结构域中包含最大限度的唾液酸化N联寡糖的含Fc分子例如 抗体的高度同质批次的制备。它进一步涉及就在Fc寡糖中包含唾液酸的抗体以及在Fc寡 糖中不包含唾液酸的抗体富集的抗体批次的纯化。 附图的几个视图的简述图1是在人IgG中发现的最大寡糖结构的示意描述。 图2描述了在中国仓鼠卵巢（CH0)细胞中产生的重组IgG中发现的主要寡糖结 构。 图3显示Fc寡糖的HPL本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种药物组合物在制备用于治疗或诊断疾病或状况的药物中的用途，所述药物组合物包含含Fc蛋白质以及药学上可接受的载体，所述含Fc蛋白质是通过用于控制细胞系中表达的含Fc分子性质的方法产生或改变的，该方法包括通过用编码产脲节杆菌唾液酸酶A的催化结构域的载体转染所述细胞系来减少所述Fc区中寡糖的唾液酸化，其中所表达的所述含Fc分子包含减少量的唾液酸残基。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：M纳索，TS拉朱，B斯卡伦，苏珊·谭，
申请(专利权)人：詹森生物科技公司，
类型：发明
国别省市：美国;US